Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Núcleo biorepositório clínico/tumoral do HIV por fornecer amostras de pacientes e o Núcleo de Metabolismo de Imunologia Celular por fornecer análise de citometria de fluxo. Este projeto foi financiado pelo NIH P20GM121288e e P30GM114732.

Todos os métodos descritos abaixo foram aprovados pelo Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Todo o sangue foi coletado após a obtenção de consentimento informado.
NOTA: Todo o procedimento é realizado em condições estéreis em uma instalação de nível 2 de biossegurança (BSL2) para que o cuidado seja usado para lidar com materiais biológicos. Em particular, cada etapa é realizada usando técnicas estéreis um armário de biossegu...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

O protocolo apresentado demonstra o uso de células primárias de indivíduos infectados pelo HIV como modelo para o estudo de monócitos e macrófagos. HIV+ pacientes submetidos a cART vivem com infecção por vários anos e também podem ter outras co-infecções relacionadas a um sistema imunológico comprometido. Para estudar a imunomodulação na presença de infecção crônica do HIV, as células foram colhidas diretamente dos pacientes. Como miRNAs têm demonstrado desempenhar papéis importantes no de...

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) causa disfunção imunológica grave, o que pode levar a infecções oportunistas e à síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Embora os pacientes infectados pelo HIV submetidos a CART sejam caracterizados por baixas cargas virais e contagens normais de células T CD4+ T, o funcionamento do sistema imunológico pode ser comprometido nesses indivíduos, levando a uma resposta imune disfuncional que tem sido associada a um risco aumentado de desenvolver câncer1. Os mecanismos de disfunção imunológica em pacientes com HIV em cART permanecem em grande parte desconhecidos. Portanto, caracterizar as células imunes derivadas do paciente e investigar sua biologia e função é um componente crítico da pesquisa atual sobre HIV.
Monócitos e macrófagos são reguladores-chave das respostas imunes e desempenham papéis fundamentais na infecção pelo HIV2,3,4,5. Heterogêneo e plástico na natureza, macrófagos podem ser amplamente classificados em ativado classicamente (M1) ou ativado alternativamente (M2). Embora essa classificação geral seja necessária na criação de condições experimentais, o status de polarização dos macrófagos pode ser revertido por uma variedade de citocinas6,7,8,9. Embora vários estudos tenham investigado os efeitos da infecção pelo HIV em monócitos e células dendríticas, detalhes moleculares de respostas mediadas por monócito são em grande parte desconhecidos6,7,10,12,12,14,15,16,17,18,19. Entre os fatores envolvidos na regulação e função das células imunes, microRNAs (miRNAs), RNAs curtos não codificadores que regulam a expressão gênica pós-transcritoria, têm demonstrado desempenhar um papel importante no contexto das principais vias celulares (ou seja, crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose)20. Estas moléculas têm sido descritas como importantes reguladores de fatores de transcrição essenciais para ditar a polarização funcional dos macrófagos21. O papel potencial dos miRNAs em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART tem sido investigado, mas o progresso no campo requer muito mais trabalho22,23,24,25,26. Este artigo discute um método otimizado para transfect miRNAs e siRNAs em monócitos humanos primários de pacientes infectados pelo HIV e controles.
Este protocolo baseia-se em reagentes e kits comercialmente disponíveis, uma vez que a continuidade no procedimento técnico ajuda a eliminar variáveis experimentais desnecessárias ao trabalhar com amostras clínicas. No entanto, o método fornece dicas importantes (ou seja, o número de células banhadas ou breve incubação com mídia livre de soro para promover a adesão das células à placa). Além disso, as condições de polarização utilizadas neste protocolo são derivadas do trabalho publicado27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser um grande problema de saúde, apesar da introdução da terapia antirretroviral combinada (cART) em meados da década de 1990. Embora a terapia antirretroviral reduza eficientemente a carga viral sistêmica e restaure a contagem normal de células T CD4+ T, ela não reconstitui um sistema imunológico completamente funcional. Um sistema imunológico disfuncional em indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART pode ser caracterizado por ativação imunológica, envelhecimento precoce de células imunes ou inflamação persistente. Essas condições, juntamente com fatores comórbidos associados à infecção pelo HIV, adicionam complexidade à doença, que não pode ser facilmente reproduzida em modelos celulares e animais. Para investigar os eventos moleculares subjacentes à disfunção imunológica nesses pacientes, um sistema para cultura e manipular monócitos primários humanos in vitro é apresentado aqui. Especificamente, o protocolo permite a cultura e transfecção do CD14 primário+ monócitos obtidos a partir de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART, bem como de controles HIV-negativos. O método envolve isolamento, cultura e transfecção de monócitos e macrófagos derivados de monócitos. Embora kits e reagentes comercialmente disponíveis estejam empregados, o protocolo fornece dicas importantes e condições otimizadas para aadesão bem-sucedida e transfecção de monócitos com miRNA imitadores e inibidores, bem como com siRNAs.

Usando o procedimento descrito, os monócitos humanos preliminares dos indivíduos HIV-contaminados e os doadores saudáveis foram isolados. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de HIV+ sujeitos submetidos a cART com baixa (<20 cópias/mL) ou cargas virais indetectáveis e contagens normais de células T CD4+ T. Imediatamente após o isolamento, as células foram manchadas, e citometria de fluxo foi realizada para confirmar a pureza das populaçõe...

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Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

A infecção pelo HIV causa disfunção imunológica mesmo em indivíduos submetidos à terapia antirretroviral sem vírus detectável. Este método permite o estudo da função monócito que são os principais reguladores da resposta imune. Otimizamos essa técnica para o isolamento, cultura e transfecção de monócitos primários humanos.Usamos este método para entender os mecanismos moleculares de disfunção imunológica em indivíduos infectados pelo HIV, mas pode ser aplicado a quaisquer outros estudos imunológicos envolvendo monócitos. Se esta é a primeira vez que trabalha com sangue humano, lembre-se de seguir os protocolos adequados de biossegurança e tratar todas as amostras como material possivelmente infeccioso. Depois de coletar 40 mililitros de sangue inteiro humano fresco em quatro tubos de vácuo EDTA mililitros, use técnica estéril para transferir todo o sangue para um único tubo de propileno cônico de 50 mililitros em um armário de biossegurança.Seguindo as instruções do fabricante a partir de um kit de isolamento de monócitos humanos selecionados, adicione dois mililitros de coquetel de isolamento de monócitos do kit ao tubo de sangue e vórtice as contas magnéticas do kit por 30 segundos. Adicione dois mililitros de contas ao sangue e use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para misturar cuidadosamente as contas com o sangue. Após cinco minutos em temperatura ambiente, divida o sangue igualmente entre quatro tubos de 50 mililitros e adicione 30 mililitros de PBS estéreis complementados com um EDTA milimillar em cada tubo.Misture novamente com uma pipeta sorológica de 25 mililitros de plástico e coloque os tubos em suportes magnéticos. Após 10 minutos, use uma pipeta para elaborar o conteúdo do centro de cada tubo, tomando cuidado para não aspirar mais de um mililitro de glóbulos vermelhos e dispensar o conteúdo do tubo em um dos quatro novos tubos de 50 mililitros. Adicione 500 microliters adicionais das contas magnéticas vórtices a cada tubo e misture suavemente a solução celular.Coloque os tubos de volta nos suportes magnéticos por cinco minutos antes de transferir cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mililitros. Quando todas as suspensões celulares tiverem sido transferidas, coloque cada novo tubo de 50 mililitros nos suportes de ímã por cinco minutos antes de transferir cuidadosamente o conteúdo do tubo para um terceiro conjunto de quatro novos tubos de 50 mililitros. Em seguida, colete as células por centrifugação e resuspenque todas as quatro pelotas de células em um total de 10 mililitros de PBS estéreis para contar.Após a contagem, resuspenque os monócitos isolados em uma única vez 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius sem soro RPMI 1640 médio suplementado com antibióticos e placa um mililitro de células resuspended em placas de 35 milímetros em um armário de biossegurança. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular por 30 a 60 minutos para permitir que as células aderam às partes inferiores do poço. Para preparar macrófagos com um fenótipo semelhante a M1, adicione 100 microliters de soro bovino fetal contendo 25 nanogramas por mililitro de GM-CSF em cada placa.Para preparar macrófagos com um fenótipo semelhante a M2, adicione 100 microliters de bovino fetal contendo 50 nanogramas por mililitro de M-CSF em cada placa. Para transfecção monócito com imitações de microRNA, inibidores ou um pequeno RNA interferindo, seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transfecção, diluir as RNAs selecionadas no buffer para uma concentração final de 1,83 micromolar em 10 microlitres de mímica diluída ou inibidor por transfecção de uma vez 10 para o volume de quintas células. Para preparar o reagente de transfecção, adicione um microliter do polímero fornecido a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione imediatamente 90 microliters do tampão fornecido pelo kit para obter um total de 91 microliters de reagente por transfecção.Vórtice o regente por três a cinco segundos e pipeta 90 microliters da solução de transfecção no tubo contendo 10 microliters de RNA diluído. Após uma mistura suave, incubar a solução por 15 minutos à temperatura ambiente antes de adicionar 100 microliters de complexo de transfecção a um poço de células. Após quatro horas a 37 graus Celsius, substitua o meio por três mililitros de meio completo contendo o fator de crescimento adequado.No sexto dia de cultura, substitua os supernacantes culturais das culturas M1 por três mililitros de médio suplementados com soro bovino fetal, antibióticos, lipopolysacarídeos e gamma interferon e substitua os supernaciantes das culturas M2 por meio suplementado com soro bovino fetal, antibióticos, M-CSF e interleucina-4. Após 24 horas de cultura, lave cada placa de macrófagos ativados duas vezes com PBS fresco por lavagem. Para análises de RNA e proteínas, lise as células anexadas diretamente nas placas para permitir a coleta do conteúdo celular liberado para sua análise.Para análise citométrica de fluxo, desprende as células com dois milimolalares EDTA em PBS por 10 minutos a 37 graus Celsius antes de raspar suavemente as células das partes inferiores da placa para permitir sua coleta em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro para sua análise. Aqui representamos histogramas de células de controle ativadas por M1 e células derivadas do paciente com níveis aumentados de células ativadas de CD80 e CD83 e M2 com níveis aumentados de CD163 e CD209 em comparação com células T0 não ativadas são mostrados. Curiosamente, CD80 e CD83 pareciam ser mais altamente expressos em células derivadas de controle em comparação com células derivadas do HIV.A transfecção de monócitos recém-coletados com um microRNA mexido quase infravermelho resulta em uma eficiência superior a 90% de transfecção determinada por citometria de fluxo e microscopia confocal. Além disso, a transfecção não reduz significativamente a viabilidade das células derivadas ou de controle do paciente, independentemente do estágio de maturação celular ou das condições de transfecção. A transfecção resulta em uma efetiva baixa do gene alvo após a transfecção com o pequeno RNA de interferência específica tanto no primeiro dia quanto no quarto dia pós-isolamento.Além disso, as células transfeccionadas com microRNA imitam um aumento de 48 a 72 vezes na expressão de microRNA sobre células não transtravadas, enquanto todos os controles de transfecção não mostram alterações apreciáveis. O número de células banhadas é fundamental para a sobrevivência. Recomendamos um milhão de células por prato de 35 milímetros.O revestimento em meio livre de soro também melhorará muito o acessório celular. As células obtidas com este método podem ser tratadas com citocinas ou fatores de crescimento para estudar respostas diferenciais em pacientes de interesse e controles saudáveis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...