Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить ВИЧ клинической / опухолевой биопозитория core для предоставления пациентов образцов и клеточной иммунологии Метаболизм ядро для обеспечения потока цитометрии анализа. Этот проект был профинансирован NIH P20GM12288 и P30GM114732.

Все методы, описанные ниже, были одобрены Университетом штата Луизиана Центр медицинских наук Нью-Орлеан Институциональный обзор совета. Вся кровь была собрана после получения информированного согласия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура выполняется в стерильных условиях в объ...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Представленный протокол демонстрирует использование первичных клеток ВИЧ-инфицированных испытуемых в качестве модели для изучения моноцитов и макрофагов. ВИЧ-и пациенты, проходящие ЛЕЧЕНИЕ, живут с инфекцией в течение нескольких лет, а также могут иметь другие сопутствующие ин...

Инфекция вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) вызывает тяжелую иммунную дисфункцию, которая может привести к оппортунистическим инфекциям и приобретенному синдрому иммунодефицита (СПИД). Хотя ВИЧ-инфицированных пациентов, проходящих CART характеризуются низкими вирусными нагрузками и нормальной CD4И Т-клеток рассчитывает, функционирование иммунной системы может быть поставлена под угрозу в этих людей, что приводит к дисфункциональной иммунной реакции, которая была связана с повышенным риском развития рака1. Механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных пациентов на КАРТ остаются в значительной степени неизвестными. Поэтому характеристика иммунных клеток, полученных пациентом, и изучение их биологии и функции является важнейшим компонентом текущих исследований в области ВИЧ.
Моноциты и макрофаги являются ключевыми регуляторами иммунных реакций и играют основополагающую роль в ВИЧ-инфекции2,3,4,5. Неоднородные и пластиковые в природе, макрофаги могут быть широко классифицированы в классическо активированных (M1) или альтернативно активированных (M2). Хотя эта общая классификация необходима при создании экспериментальных условий, статус поляризации макрофагов может быть обращен вспять различными цитокинов6,7,8,9. Хотя несколько исследований исследовали влияние ВИЧ-инфекции на моноциты и дендритные клетки, молекулярные детали моноцитных реакций в значительной степени неизвестны6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Среди факторов, участвующих в регуляции и функции иммунных клеток, микроРНК (миРНК), короткие некодировочные РНК, которые после транскрипционно регулируют экспрессию генов, были показаны, чтобы играть важную роль в контексте основных клеточных путей (т.е. рост, дифференциация, развитие, и апоптоз)20. Эти молекулы были описаны как важные регуляторы транскрипционных факторов, необходимых для диктовки функциональной поляризации макрофагов21. Исследована потенциальная роль миРНК в моноцитах ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, но прогресс в этой области требует гораздо больше работы22,23,24,25,26. В настоящем документе обсуждается оптимизированный метод перевода миРНК и сирны в первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных пациентов и контроля.
Этот протокол опирается на коммерчески доступные реагенты и комплекты, так как непрерывность технической процедуры помогает устранить ненужные экспериментальные переменные при работе с клиническими образцами. Тем не менее, метод предоставляет важные советы (т.е. количество клеток, покрытых или краткое инкубации с сыворотки свободной среды для содействия присоединению клеток к пластине). Кроме того, условия поляризации, используемые в этом протоколе, вытекают из опубликованной работы27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) остается серьезной проблемой для здоровья, несмотря на внедрение комбинированной антиретровирусной терапии (САРТ) в середине 1990-х годов. В то время как антиретровирусная терапия эффективно снижает системную вирусную нагрузку и восстанавливает нормальные количество CD4и Т-клеток, она не восстанавливает полностью функциональную иммунную систему. Дисфункциональная иммунная система у ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих КРТ, может характеризоваться иммунной активацией, ранним старением иммунных клеток или постоянным воспалением. Эти условия, наряду с сопутствующими факторами, связанными с ВИЧ-инфекцией, усугубляют сложность болезни, которая не может быть легко воспроизведена в клеточных и животных моделях. Для исследования молекулярных событий, лежащих в основе иммунной дисфункции у этих пациентов, система культуры и манипулировать человеческими первичными моноцитами in vitro представлена здесь. В частности, протокол допускает культуру и трансфекцию первичных монцитов CD14и, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц, проходящих ЦАРТ, а также вич-отрицательных мер контроля. Метод включает в себя изоляцию, культуру и трансфекцию моноцитов и моноцитов, полученных макрофагами. В то время как коммерчески доступные комплекты и реагенты используются, протокол обеспечивает важные советы и оптимизированные условия для успешного присоединения и трансфекции моноцитов с миРНК мимикрирующими и ингибиторами, а также с siRNAs.

Используя описанную процедуру, были выделены первичные моноциты человека от ВИЧ-инфицированных людей и здоровых доноров. Все данные, представленные здесь, были получены из ВИЧ-испытуемых, подвергаясь АРТ с низким (злт;20 коп/мл) или необнаруживаемыми вирусными на...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Здесь представлен оптимизированный протокол для изоляции, культивирования, трансфектирования и дифференциации первичных моноцитов человека от ВИЧ-инфицированных лиц и здорового контроля.

Изоляция, Трансфекция и культура первичных человеческих моноцитов

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

ВИЧ-инфекция вызывает иммунную дисфункцию даже у лиц, проходящих антиретровирусную терапию без обнаруженного вируса. Этот метод позволяет изучать функции моноцитов, которые являются ключевыми регуляторами иммунного ответа. Мы оптимизировали этот метод для изоляции, культуры и трансфекции первичных моноцитов человека.Мы используем этот метод, чтобы понять молекулярные механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных людей, но он может быть применен к любым другим иммунным исследованиям с участием моноцитов. Если вы впервые работаете с человеческой кровью, не забудьте следовать надлежащим протоколам биобезопасности и рассматривать все образцы как возможно инфекционный материал. После сбора 40 миллилитров свежей человеческой цельной крови в четырех 10 миллилитров EDTA вакуумных трубок, использовать стерильную технику для передачи всей крови в один 50 миллилитров конического пропилена трубки в биобезопасности кабинета.Следуя инструкциям производителя из выбранного человека комплект изоляции моноцитов, добавить два миллилитров моноцитов изоляции коктейль из комплекта в трубку крови и вихрь магнитных бусин из комплекта в течение 30 секунд. Добавьте в кровь два миллилитров бисера и используйте серологическую пипету на 25 миллилитров, чтобы тщательно смешать бисер с кровью. После пяти минут при комнатной температуре, разделить кровь поровну между четырьмя 50 миллилитров трубки и добавить 30 миллилитров стерильных PBS дополняется одним миллимолярной ЭДТА для каждой трубки.Снова смешайте с пластиковой 25 миллилитров серологической пипетки и поместите трубки в магнитных держателей. Через 10 минут используйте пипетку, чтобы составить содержимое из центра каждой трубки, заботясь, чтобы не аспирировать более одного миллилитра красных кровяных телец и распределить содержимое трубки в одну из четырех новых 50 миллилитров труб. Добавьте 500 дополнительных микролитров вихревых магнитных бусин к каждой трубке и аккуратно смешайте клеточный раствор.Поместите трубки обратно в магнитные держатели в течение пяти минут, прежде чем тщательно передавать содержимое из центра каждой трубки в одну из четырех новых 50 миллилитров труб. Когда все подвески клетки были перенесены, поместите каждую новую 50-миллилитровую трубку в магнитные держатели в течение пяти минут, прежде чем тщательно перенести содержимое трубки в третий набор из четырех новых 50 миллилитров труб. Затем соберите клетки путем центрифугации и повторно посовечите все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 миллилитров стерильных PBS для подсчета.После подсчета, resuspend изолированных моноцитов в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр 37 градусов по Цельсию сыворотки свободной RPMI 1640 среды дополняется антибиотиками и пластины один миллилитр resuspended клеток в 35 миллиметров пластин в биобезопасности кабинета. Затем поместите пластины в инкубатор культуры клеток на 30-60 минут, чтобы клетки придерживались дна. Чтобы загрунтовывать макрофаги с фенотипом M1, добавьте 100 микролитров сыворотки крупного рогатого скота плода, содержащей 25 нанограмм на миллилитр ГМ-CSF к каждой пластине.Чтобы загрунтовывать макрофаги с фенотипом M2, добавьте 100 микролитров крупного рогатого скота плода, содержащих 50 нанограмм на миллилитр M-CSF к каждой пластине. Для моноцитов трансфекции с микроРНК имитирует, ингибиторы, или небольшой вмешательства РНК, следуя протоколу производителя для трансфекции комплект, разбавить выбранных РНК в буфере до конечной концентрации 1,83 микромолара в 10 микролитров разбавленной имитации или ингибитора на трансфекцию один раз от 10 до пятого объема клеток. Чтобы подготовить трансфектальный реагент, добавьте один микролитр предоставленного полимера в 1,5 миллилитровую микроцентрифуговую трубку и немедленно добавьте 90 микролитров буфера, предоставленного комплектом, чтобы получить в общей сложности 91 микролитр реагента на трансфекцию.Вихрь регента в течение трех-пяти секунд и пипетка 90 микролитров трансфектного раствора в трубку, содержащую 10 микролитров разбавленной РНК. После нежного смешивания инкубировать раствор в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем добавить 100 микролитров трансфектного комплекса в одну колодец клеток. После четырех часов при 37 градусах по Цельсию замените среду тремя миллилитровами полной среды, содержащими соответствующий фактор роста.На шестой день культуры замените культурные супернатанты из культур М1 тремя миллилитровами среды, дополненными сывороткой крупного рогатого скота плода, антибиотиками, липополисахаридом и интерфероном гамма и замените супернатанты из культур М2 средой, дополненной сывороткой из крупного рогатого скота плода, антибиотиками, M-CSF и интерлейкином-4. После 24 часов культуры, мыть каждую тарелку активированных макрофагов два раза со свежим PBS за стирку. Для анализа РНК и белка, подлизать прилагаемые клетки непосредственно в пластинах, чтобы сбор выпущенного содержимого клеток для их анализа.Для цитометрического анализа потока, отсоедините клетки с двумя миллимолярной ЭДТА в PBS в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем аккуратно соскоб клетки от дна пластины, чтобы их сбор в 1,5 миллилитров микроцентрифуг труб для их анализа. Здесь показаны репрезентативные гистограммы M1-активированного контроля и клеток, полученных пациентом, с повышенным уровнем CD80 и CD83 и M2-активированных клеток с повышенным уровнем CD163 и CD209 по сравнению с неактивными Т0-клетками. Интересно, что CD80 и CD83, как представляется, более высоко выражены в клетках, полученных из-под контроля, по сравнению с клетками, полученными из ВИЧ.Трансфекция свежесобранных моноцитов с скремблированной почти инфракрасной помеченной микроРНК приводит к более чем 90%-ной эффективности трансфекции, определяемой цитометрией потока и конфокарной микроскопией. Кроме того, трансфекция не значительно снижает жизнеспособность клеток, полученных пациентом, или контрольных клеток, независимо от стадии созревания клеток или условий трансфекции. Трансфекция приводит к эффективному downregulation целевого гена при трансфекции с конкретными малых вмешательства РНК в один день и день четыре после изоляции.Кроме того, клетки, трансфицированные микроРНК-мимикой, демонстрируют 48-72-кратное увеличение экспрессии микроРНК по нетрансфицированным клеткам, в то время как все элементы управления трансфектом не показывают заметных изменений. Количество потроха клеток имеет решающее значение для выживания. Рекомендуем один миллион клеток на 35-миллиметровую тарелку.Покрытие в среде, свободной от сыворотки, также значительно улучшит клеточное вложение. Клетки, полученные с помощью этого метода можно лечить с цитокинами или факторами роста для изучения дифференциальной реакции у пациентов, представляющих интерес и здорового контроля.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Генерация органотипической культур Плот из первичных кератиноцитов человека

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...