Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Författarna vill tacka HIV Clinical/tumör Biorepository kärna för att tillhandahålla patientprover och cellulära immunologi metabolism kärna för att tillhandahålla flödescytometri analys. Projektet finansierades av NIH P20GM121288 och P30GM114732.

Alla metoder som beskrivs nedan har godkänts av Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutionella Review Board. Allt blod samlades in efter att ha erhållit informerat samtycke.
Anmärkning: hela proceduren utförs under sterila förhållanden i en biosäkerhet Level 2 (BSL2) anläggning så att försiktighet används för att hantera biologiska material. I synnerhet utförs varje steg med steril teknik under ett biosäkerhetsskåp. Efter varje steg som involverar ...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Det presenterade protokollet visar användningen av primära celler från HIV-infekterade försökspersoner som en modell för att studera monocyter och makrofager. HIV+ patienter som genomgår cART lever med infektion i flera år och kan också ha andra co-infektioner relaterade ett nedsatt immunförsvar. För att studera Immunomodulering i närvaro av HIV-kronisk infektion, celler skördats från patienter direkt. Som miRNAs har visat sig spela stora roller i cell utveckling och differentiering, fokuserar pr...

Humant immunbristvirus-1 (HIV-1) infektion orsakar svår immun dysfunktion, vilket kan leda till opportunistiska infektioner och förvärvade immunbristsyndrom (AIDS). Även om HIV-infekterade patienter som genomgår cART kännetecknas av låg virusbelastning och normala CD4+ T-celler räknas, kan funktionen hos immunförsvaret äventyras hos dessa individer, vilket leder till en dysfunktionell immunsvar som har kopplats till en ökad risk att utveckla cancer1. Mekanismerna för immun dysfunktion hos HIV-patienter i cART är fortfarande i stort sett okända. Därför är att karakterisera patient-derived immunceller och undersöka deras biologi och funktion är en kritisk komponent i nuvarande HIV-forskning.
Monocyter och makrofager är viktiga regulatorer av immunsvar och spela grundläggande roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogena och plast i naturen, makrofager kan grovt klassificeras i klassiskt aktiverad (M1) eller alternativt aktiverad (m2). Även om denna allmänna klassificering är nödvändig när man ställer upp experimentella tillstånd, kan polarisation status av makrofager vändas genom en mängd olika cytokiner6,7,8,9. Även om flera studier har undersökt effekterna av hiv-infektion på monocyter och dendritiska celler, molekylära detaljer i monocyte-medierade svar är i stort sett okända6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bland de faktorer som är involverade i immun cells reglering och funktion, microRNAs (miRNAs), korta icke-kodning RNAs att post-transkriptionellt reglera genuttryck, har visat sig spela en viktig roll i samband med stora cellulära vägar (dvs. tillväxt, differentiering, utveckling, och apoptos)20. Dessa molekyler har beskrivits som viktiga regulatorer av transkriptionsfaktorer avgörande för diktera funktionell polarisering av makrofager21. Den potentiella roll mirnas i monocyter från hiv-infekterade personer som genomgår cART har undersökts, men framsteg inom området kräver mycket mer arbete22,23,24,25,26. Denna uppsats diskuterar en optimerad metod för att transfect miRNAs och siRNAs i primära humana monocyter från HIV-infekterade patienter och kontroller.
Detta protokoll bygger på kommersiellt tillgängliga reagenser och byggsatser, eftersom kontinuiteten i det tekniska förfarandet hjälper till att eliminera onödiga experimentella variabler vid arbete med kliniska prover. Icke desto mindre, metoden ger viktiga tips (dvs, antalet celler pläterad eller kort inkubation med serum-fria medier för att främja efterlevnaden av celler till plattan). Dessutom kommer de polariserings förhållanden som används i detta protokoll att härledas från publicerat arbete27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande ett stort hälsoproblem trots införandet av kombinerad antiretroviral behandling (cART) i mitten av 1990-talet. Medan antiretroviral behandling effektivt sänker systemisk virusbelastning och återställer normala CD4+ T-celler räknas, det inte rekonstituerar ett helt funktionellt immunförsvar. Ett dysfunktionellt immunsystem i HIV-infekterade individer som genomgår cART kan kännetecknas av immunförsvaret aktivering, tidigt åldrande av immunceller, eller ihållande inflammation. Dessa villkor, tillsammans med comorbida faktorer förknippade med HIV-infektion, lägga komplexitet till sjukdomen, som inte lätt kan återges i cellulära och djurmodeller. För att undersöka molekylära händelser underliggande immun dysfunktion hos dessa patienter, ett system för att kultur och manipulera mänskliga primära monocyter in vitro presenteras här. Specifikt tillåter protokollet för kulturen och transfektion av primära CD14+ monocyter som erhållits från hiv-infekterade personer som genomgår cART samt från hiv-negativa kontroller. Metoden innebär isolering, kultur, och transfektion av monocyter och monocyte-härledda makrofager. Medan kommersiellt tillgängliga kit och reagens används, ger protokollet viktiga tips och optimerade förutsättningar för framgångsrik följsamhet och transfektion av monocyter med Mirna härmar och hämmare samt med sirnas.

Med hjälp av det beskrivna förfarandet isolerades primära humana monocyter från HIV-infekterade individer och friska donatorer. Alla data som presenteras här erhölls från HIV+ ämnen som genomgår cART med låg (< 20 kopior/ml) eller omätbara virus laster och normala CD4+ T-celler räknas. Omedelbart efter isolering, celler färgas, och flödescytometri utfördes för att bekräfta renheten hos cellpopulationer. Resultaten visade att > 97% av cellerna färgad...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Presenteras här är ett optimerat protokoll för att isolera, odling, transfecting, och differentiera mänskliga primära monocyter från HIV-infekterade individer och friska kontroller.

Isolering, transfektion och kultur av primära mänskliga monocyter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV-infektion orsakar immundysfunktion även hos individer som genomgår antiretroviral behandling utan påvisbart virus. Denna metod möjliggör för studier av monocytfunktion som är viktiga regulatorer av immunsvaret. Vi har optimerat denna teknik för isolering, kultur och transfection av mänskliga primära monocyter.Vi använder denna metod för att förstå de molekylära mekanismerna för immun dysfunktion hos HIV-infekterade individer, men det kan tillämpas på alla andra immun studier med monocyter. Om detta är första gången du arbetar med humant blod, kom ihåg att följa rätt biosäkerhet protokoll och att behandla alla prover som eventuellt smittsamt material. Efter att ha samlat 40 milliliter färskt mänskligt helblod i fyra 10 milliliter EDTA vakuumrör, använd steril teknik för att överföra allt blod till en enda 50 milliliter konisk propen rör i en biosäkerhet skåp.Efter tillverkarens instruktioner från en utvald humanmonocyte isolering kit, tillsätt två milliliter av monocyter isolering cocktail från kit till röret av blod och virvel de magnetiska pärlor från satsen i 30 sekunder. Tillsätt två milliliter pärlor i blodet och använd en 25 milliliter serologisk pipett för att noggrant blanda pärlorna med blodet. Efter fem minuter i rumstemperatur, dela blodet lika mellan fyra 50 milliliter rör och tillsätt 30 milliliter steril PBS kompletteras med en millimolar EDTA till varje rör.Blanda igen med en 25 milliliter serologisk pipet i plast och placera rören i magnetiska hållare. Efter 10 minuter, använd en pipett för att dra upp innehållet från mitten av varje rör noga med att inte aspirera mer än en milliliter röda blodkroppar och fördela röret innehållet i en av fyra nya 50 milliliter rör. Tillsätt ytterligare 500 mikroliter av de virvelade magnetiska pärlorna till varje rör och blanda försiktigt celllösningen.Placera rören tillbaka i magnethållarna i fem minuter innan du försiktigt överför innehållet från mitten av varje rör till ett av fyra nya 50 milliliterrör. När alla cellupphängningar har överförts, placera varje nytt 50 milliliterrör i magnethållarna i fem minuter innan du noggrant överför rörinnehållet till en tredje uppsättning av fyra nya 50 milliliterrör. Samla sedan cellerna genom centrifugeringen och resuspend alla fyra cell pellets i totalt 10 milliliter av steril PBS för räkning.Efter räkning, resuspend de isolerade monocyterna på en en gånger 10 till sjätte celler per milliliter av 37 grader Celsius serum-free RPMI 1640 medium kompletteras med antibiotika och platta en milliliter av resuspended celler i 35 millimeter plattor i en biosäkerhet skåp. Placera sedan plattorna i cellodlingsinkubatorn i 30 till 60 minuter så att cellerna kan hålla sig till brunnsbottnarna. Till prime för makrofager med en M1-liknande fenotyp, lägga till 100 mikroliter av fetala nötkreatur serum som innehåller 25 nanogram per milliliter av GM-CSF till varje platta.Till prime för makrofager med en M2-liknande fenotyp, lägga till 100 mikroliter av fetala nötkreatur som innehåller 50 nanogram per milliliter M-CSF till varje platta. För monocyte transfektion med mikroRNA härmar, hämmare, eller en liten störande RNA, efter tillverkarens protokoll för transfektionssatsen, späd ut de valda RNA i bufferten till en slutkoncentration på 1,83 mikromolar i 10 mikroliter av utspädda härma eller hämmare per transinfektion av en gånger 10 till den femte cellernas volym. För att förbereda transfektionsreagensen, tillsätt en mikroliter av den medföljande polymeren till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och tillsätt omedelbart 90 mikroliter av den kit-tillhandahållna bufferten för att erhålla totalt 91 mikroliter reagens per transfektion.Vortexa regenten i tre till fem sekunder och pipetter 90 mikroliter av transfektionslösningen in i röret som innehåller 10 mikroliter av utspädd RNA. Efter skonsam blandning, inkubera lösningen i 15 minuter vid rumstemperatur innan du lägger till 100 mikroliter transfektionskomplex till en brunn av celler. Efter fyra timmar vid 37 grader Celsius, ersätta mediet med tre milliliter av komplett medium som innehåller lämplig tillväxtfaktor.På dag sex av kultur, ersätta kulturen supernatants från M1 kulturerna med tre milliliter medium kompletteras med fetala nötkreatur serum, antibiotika, lipopolysackarid och interferon gamma och ersätta supernatanterna från M2 kulturerna med medium kompletteras med fetala nötkreatur serum, antibiotika, M-CSF och interleukin-4. Efter 24 timmars kultur, tvätta varje platta av aktiverade makrofager två gånger med färsk PBS per tvätt. För RNA och proteinanalyser, lysa de bifogade cellerna direkt i plattorna för att möjliggöra insamling av det frisläppta cellinnehållet för deras analys.För flödescytometrisk analys, lossa cellerna med två millimolar EDTA i PBS i 10 minuter vid 37 grader Celsius innan försiktigt skrapa cellerna från plattan bottnar för att tillåta deras insamling i 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för deras analys. Här representativa histogram av M1-aktiverad kontroll och patient-derived celler med ökade nivåer av CD80 och CD83 och M2-aktiverade celler med ökade nivåer av CD163 och CD209 jämfört med icke-aktiverade T0 celler visas. Intressant, CD80 och CD83 verkade vara mer uttrycks i kontroll-härledda celler jämfört med HIV-härledda celler.Transfektionen av nyuppsamlade monocyter med en kodade nära infraröd märkt microRNA resulterar i en större än 90%effektivitet av transfektion som bestäms av flödescytometri och confocal mikroskopi. Dessutom minskar transfection inte signifikant livskraften hos patient-härledda celler eller kontrollceller oavsett stadium av cellmognad eller transfektionsförhållandena. Transfection resulterar i en effektiv nedreglering av målgenen vid transfection med de specifika små störande RNA vid både dag ett och dag fyra post-isolering.Vidare visar celler transfected med microRNA mimic en 48 till 72-faldig ökning av mikroRNA-uttryck över otransfekterade celler medan alla transfektionskontroller visar inga märkbara förändringar. Antalet celler pläterade är avgörande för överlevnad. Vi rekommenderar en miljon celler per 35 millimeters maträtt.Plätering i serumfritt medium kommer också att avsevärt förbättra cellens fastsättning. Celler som erhålls med denna metod kan behandlas med cytokiner eller tillväxtfaktorer för att studera differentialsvar hos patienter av intresse och friska kontroller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering av Organotypiska Raft kulturer från Primary humana keratinocyter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live avbildning antimykotiskt av humana primära neutrofiler och monocyter som svar på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...