Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Yazarlar hiv Klinik / Tümör Biorepozitory Core hasta örnekleri ve hücresel immünoloji metabolizma çekirdek akış sitometri analizi sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH P20GM121288 ve P30GM114732 tarafından finanse edilmiştir.

Aşağıda açıklanan tüm yöntemler Louisiana State University Sağlık Bilimleri Merkezi New Orleans Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm kan bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı.
NOT: Biyolojik malzemelerin iştininde dikkatli olunması için tüm işlem biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) tesisinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Özellikle, her adım bir biyogüvenlik kabine altında steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. Kan,...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Sunulan protokol, monosit ve makrofajların incelenmesinde bir model olarak HIV ile enfekte olmuş deneklerin birincil hücrelerinin kullanımını göstermektedir. HIV+ cART geçiren hastalar birden fazla yıl enfeksiyon ile yaşamak ve aynı zamanda diğer co-enfeksiyonlar tehlikeye bağışıklık sistemi ile ilgili olabilir. HIV kronik enfeksiyon varlığında immünomodülasyon çalışma için, hücreler doğrudan hastalardan hasat edildi. MiRNA'ların hücre gelişimi ve farklılaşmasında önemli rol ...

İnsan immün yetmezlik virüs-1 (HIV-1) enfeksiyonu fırsatçı enfeksiyonlara ve edinsel immün yetmezlik sendromuna (AIDS) yol açabilen ciddi immün fonksiyon bozukluğuna neden olur. Hiv-enfekte hastalar cART geçiren düşük viral yükler ve normal CD4+ T hücre sayıları ile karakterize olmasına rağmen, bağışıklık sisteminin işleyişi bu kişilerde tehlikeye olabilir, kanser gelişme riski ile bağlantılı olan işlevsiz bir bağışıklık yanıtına yol açan1. CART'taki HIV hastalarında immün disfonksiyon mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu nedenle, hasta kaynaklı bağışıklık hücrelerinin karakterize ve biyoloji ve fonksiyon araştırılması mevcut HIV araştırmanın önemli bir bileşenidir.
Monositler ve makrofajlar bağışıklık yanıtlarının temel düzenleyicileridir ve HIV enfeksiyonu2,3,4,5'tetemel rol oynarlar. Heterojen ve plastik doğada makrofajlar klasik olarak aktive (M1) veya alternatif olarak aktive (M2) olarak sınıflandırılabilir. Deneysel koşullar belirlenirken bu genel sınıflandırma gerekli olmakla birlikte, makrofajların polarizasyon durumu çeşitli sitokinler6,7,8,9ile tersine çevrilebilir. Çeşitli çalışmalar monositler ve dendritik hücreler üzerinde HIV enfeksiyonu etkilerini araştırmış olsa da, monosit aracılı yanıtların moleküler detayları büyük ölçüde bilinmemektedir6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bağışıklık hücresi regülasyonu ve fonksiyonu ile ilgili faktörler arasında, mikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan RNA'ların, büyük hücresel yollar (yani büyüme, farklılaşma, gelişme ve apoptoz) bağlamında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir20. Bu moleküller, makrofajların fonksiyonel polarizasyonunu dikte etmek için gerekli transkripsiyon faktörlerinin önemli düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır21. CART uygulanan HIV enfekte bireylerin monositlerde miRNA potansiyel rolü araştırılmıştır, ancak alanında ilerleme çok daha fazla çalışma gerektirir22,23,24,25,26. Bu makalede, miRNA'ları ve siRNA'ları HIV ile enfekte olmuş hastalardan ve kontrollerden birincil insan monositlerine dönüştürmek için optimize edilmiş bir yöntem tartışılmaktadır.
Bu protokol, teknik prosedürdeki süreklilik klinik numunelerle çalışırken gereksiz deneysel değişkenlerin ortadan kaldırılmasına yardımcı olduğu için, ticari olarak kullanılabilen reaktiflere ve kitlere dayanır. Bununla birlikte, yöntem önemli ipuçları sağlar (yani, plaka hücrelerinin yapışmasını teşvik etmek için serumsuz medya ile kaplanmış veya kısa kuluçka hücre sayısı). Ayrıca, bu protokolde kullanılan polarizasyon koşulları yayınlanan çalışma27,28,29türetilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1990'ların ortalarında kombine antiretroviral tedavi (cART) getirilmesine rağmen önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Antiretroviral tedavi sistemik viral yükü etkin bir şekilde düşürürken ve normal CD4+ T hücre sayılarını geri getirirken, tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemini yeniden oluşturmaz. CART uygulanan HIV-enfekte bireylerde işlevsiz bir bağışıklık sistemi bağışıklık aktivasyonu ile karakterize olabilir, bağışıklık hücrelerinin erken yaşlanma, ya da kalıcı inflamasyon. Bu koşullar, HIV enfeksiyonu ile ilişkili komorbid faktörler ile birlikte, kolayca hücresel ve hayvan modellerinde çoğaltılamaz hastalık, karmaşıklık ekleyin. Bu hastalarda immün disfonksiyonun altında yatan moleküler olayları araştırmak için, insan primer monositlerini in vitro olarak manipüle eden bir sistem sunulmuştur. Özellikle protokol, cART uygulanan HIV bulaşmış bireylerden ve HIV-negatif kontrollerden elde edilen birincil CD14+ monositlerin kültür ve transfeksiyonuna olanak sağlar. Yöntem, monositlerin ve monosit kaynaklı makrofajların izolasyon, kültür ve transfeksiyonu içerir. Ticari olarak mevcut kitler ve reaktifler kullanılırken, protokol miRNA mimikleri ve inhibitörleri ile monositlerin başarılı bir şekilde yapışması ve transfeksiyonu için önemli ipuçları ve optimize edilmiş koşullar sağlar.

Açıklanan prosedür kullanılarak, HIV ile enfekte bireyler ve sağlıklı donörlerin birincil insan monositleri izole edildi. Burada sunulan tüm veriler düşük (<20 kopya/mL) veya tespit edilemeyen viral yükler ve normal CD4+ T hücre sayıları ile cART uygulanan HIV+ deneklerden elde edilmiştir. İzolasyondan hemen sonra hücreler boyandı ve hücre popülasyonlarının saflığını doğrulamak için akış sitometrisi yapıldı. Sonuçlar, hücrelerin %9...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV enfeksiyonu saptanabilir virüs ile antiretroviral tedavi gören bireylerde bile bağışıklık disfonksiyonu na neden olur. Bu yöntem bağışıklık yanıtının temel düzenleyicileri olan monosit fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniği insan birincil monositlerinin izolasyonu, kültürü ve transfeksiyonu için optimize ettik.Biz HIV enfekte bireylerde bağışıklık disfonksiyonu moleküler mekanizmaları anlamak için bu yöntemi kullanmak, ancak monositler içeren diğer bağışıklık çalışmaları uygulanabilir. Bu insan kanı ile çalışan ilk kez ise, uygun biyogüvenlik protokolleri takip etmek ve muhtemelen bulaşıcı malzeme olarak tüm örnekleri tedavi etmek için unutmayın. Dört 10 mililitre EDTA vakum tüpleri taze insan tam kan 40 mililitre topladıktan sonra, bir biyogüvenlik kabine tek bir 50 mililitre konik propilen tüp içine tüm kan aktarmak için steril tekniği kullanın.Seçilen bir insan monosit izolasyon kiti üreticinin talimatları na göre, kitten kan tüpüne monosit izolasyon kokteyli iki mililitre ekleyin ve 30 saniye boyunca kiti manyetik boncuk girdap. Kana iki mililitre boncuk ekleyin ve boncukları kanla dikkatlice karıştırmak için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, dört 50 mililitre tüpler arasında eşit kan bölünmüş ve her tüp eki bir milimolar EDTA ile takviye steril PBS 30 mililitre ekleyin.Plastik 25 mililitre serolojik pipet ile tekrar karıştırın ve tüpleri manyetik tutuculara yerleştirin. 10 dakika sonra, her tüpün merkezinden kırmızı kan hücrelerinin bir mililitreden fazla aspire ve dört yeni 50 mililitre tüpler içine tüp içeriğini dağıtmak için dikkat alarak içeriğini çizmek için bir pipet kullanın. Her tüp girdaplı manyetik boncuk500 ek mikrolitre ekleyin ve yavaşça hücre çözeltisi karıştırın.Tüpleri, her tüpün merkezinden dört yeni 50 mililitrelik tüpten birine dikkatlice aktarmadan önce beş dakika boyunca manyetik tutuculara geri yerleştirin. Tüm hücre süspansiyonları aktarıldığında, her yeni 50 mililitrelik tüpü mıknatıs tutuculara beş dakika boyunca yerleştirin ve tüp içeriğini üç yeni 50 mililitrelik tüplerden oluşan üçüncü bir sete dikkatlice aktarın. Sonra santrifüj ile hücreleri toplamak ve sayım için steril PBS toplam 10 mililitre dört hücre pelet resuspend.Sayma sonra, bir kez 10 mililitre başına altıncı hücrelere 10 antibiyotik ve plaka bir mililitre resuspended hücrelerin bir mililitre ile desteklenen bir kez 10 bir biyogüvenlik kabine 35 milimetre plakalar içine askıya aldı. Daha sonra hücreleri kuyu diplerine yapışmasını sağlamak için 30 ila 60 dakika hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin. M1 benzeri fenotipli makrofajlar için, her plakaya mililitre başına 25 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır serumu ekleyin.M2 benzeri fenotipli makrofajlar için, her plakaya mililitre başına 50 nanogram içeren 100 mikrolitre fetal sığır ekleyin. MikroRNA mimikleri, inhibitörleri veya küçük bir müdahaleci RNA ile monosit transfeksiyon için, transfeksiyon kiti için üreticinin protokolünü izleyerek, tamponda seçilen RNA'ları 10 mikrolitre seyreltilmiş mimik veya inhibitör transfeksiyon başına 10 mikrolitrede son konsantrasyona seyreltin. Transfeksiyon reaktifini hazırlamak için, sağlanan polimerin bir mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve transfeksiyon başına toplam 91 mikrolitre reaktif elde etmek için kit tarafından sağlanan tamponun 90 mikrolitresini hemen ekleyin.Girdap naip 3-5 saniye ve pipet 90 mikrolitre transfeksiyon çözeltisi içeren tüp içine seyreltilmiş RNA 10 mikrolitre içeren. Hafif çeşnilen sonra, bir hücre kuyusuna 100 mikrolitre transfeksiyon kompleksi eklemeden önce çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derece dört saat sonra, uygun büyüme faktörü içeren tam orta üç mililitre ile orta değiştirin.Kültürün altıncı gününde, M1 kültürlerinden gelen kültür süpernatanlarını fetal sığır serumu, antibiyotikler, lipopolisakkarit ve interferon gama ile takviye edilmiş üç mililitre orta ile değiştirin ve M2 kültürlerinden süpernatantları fetal sığır serumu, antibiyotikler, M-CSF ve interlökin-4 ile takviye li olarak değiştirin. 24 saatlik kültürden sonra, her bir aktif makrofaj plakasını her yıkama başına taze PBS ile iki kez yıkayın. RNA ve protein analizleri için, serbest bırakılan hücre içeriğinin analizleri için toplanması için doğrudan plakalara iliştirin.Akış sitometrik analizi için, PBS'de iki milimolar EDTA ile hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika ayırın ve hücreleri plaka diplerinden hafifçe kazıyarak 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ayırın. Burada CD80 ve CD83 düzeylerinde artmış M1-aktive kontrol ve hasta kaynaklı hücrelerin histogramları ile CD163 ve CD209 düzeylerinde artmış CD163 ve CD209 ile aktive edilmeyen T0 hücrelerine göre gösterilmiştir. İlginçtir, CD80 ve CD83 daha yüksek hiv kaynaklı hücrelere göre kontrol kaynaklı hücrelerde ifade gibi görünüyordu.Yeni toplanan monositlerin yakın kızılötesi etiketli mikroRNA ile transfeksiyonu, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile belirlenen transfeksiyonun %90'ından daha fazla verim elde etmesini sağlar. Buna ek olarak, transfeksiyon önemli ölçüde hücre olgunlaşma veya transfeksiyon koşulları aşamasından bağımsız olarak hasta kaynaklı veya kontrol hücrelerinin canlılığını azaltmaz. Transfeksiyon, transfeksiyon üzerine hedef genin etkili bir şekilde aşağılanmasına neden olur ve izolasyon sonrası dördüncü gün ve dördüncü gün spesifik küçük müdahale eden RNA ile.Ayrıca, mikroRNA mimik ile transfected hücreler transfeksiyon olmayan hücreler üzerinde mikroRNA ekspresyonunda 48-72 kat artış gösterirken, transfeksiyon kontrollerinin tümü kayda değer bir değişiklik göstermez. Kaplanmış hücrelerin sayısı hayatta kalmak için çok önemlidir. Biz 35 milimetrelik çanak başına bir milyon hücre öneririz.Serumsuz ortamda kaplama da büyük ölçüde hücre eki artıracaktır. Bu yöntemle elde edilen hücreler, ilgi çeken ve sağlıklı kontroledilen hastalarda diferansiyel yanıtları incelemek için sitokinler veya büyüme faktörleri ile tedavi edilebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...