Name: cell cycle-specific measurement of &#947;h2ax and apoptosis after genotoxic stress by flow cytometry
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle-specific Measurement of Î³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry at JoVE.com

אנו מודים לצוות המתקן הרפואי של המרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ) על תמיכתם.

1. הכנה
<ol><li>
הכן ≥ 1 x 105 תאים/מדגם בכל סוג של כלי התרבות כחומר התחלתי.
	<ol>
<li>לדוגמה, התנהלות ניסוי זמן-קורס לאחר חשיפת התאים U87 גליסטומה לקרינה מייננת: Irradiate קרנת U87 תאים sub-confluent בצלוחיות T25 ב טרילקטים עבור כל נקודת זמן. בחר בזמן מוקדם נקודות (15 דקות עד 8 h לאחר ההקרנה) כדי לעקוב אחר...

<ol>
	<li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab:+the+NEAR+protocol+(NCT00115518).">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122 (2006).</li><li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+(Gleevec).">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li><li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor/Platelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy.">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy,+temozolomide,+and+the+novel+TGF-&#946;+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761.">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-&#946; receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li><li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma,+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation.">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage,+Aging,+and+Cancer.">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li><li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks.">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Damage+Response:+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives.">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Kr&#252;ger, I., Thompson, L. H., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle.">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li><li>Escribano-D&#237;az, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice.">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice.">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li><li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer:+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation.">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li><li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells.">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li><li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines.">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).</li><li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+&#947;H2AX+expression+in+osteosarcoma,+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation.">Suberoylanilide hydroxamic acid affects &#947;H2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li><li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model.">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).</li><li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation.">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li><li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy.">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li><li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition.">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li><li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin.">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035 (2016).</li><li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment.">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645 (2016).</li><li>R&#252;hle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells.">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li><li>M&#252;nz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment.">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).</li><li>R&#252;hle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin.">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li><li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry.">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li><li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry.">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li><li>Costes, S. V., Boissi&#232;re, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts.">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li><li>Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li><li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci.">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li><li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice.">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li><li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks.">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li><li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping.">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161 (2017).</li><li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy.">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).</li><li>B&#246;cker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Methods+for+analysis+of+foci:+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells.">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li><li>L&#246;brich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair:+Strengths,+limitations+and+optimization.">&#947;H2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li></ol>

השיטה הכוללת היא קלה לשימוש ומציעה מדידה מהירה, מדויקת ומתחודש של התגובה נזק DNA כולל הפסקה כפולה הגדיל (DSB) אינדוקציה ותיקון, מחזור התא אפקטים מוות תאים האפוטוטיים. השילוב של נקודות קצה אלה מספק תמונה מלאה יותר של יחסי הגומלין שלהם מאשר הפרט היחיד. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כשיקול ...

המטרה של אונקולוגיה היא להרוג או להשבית תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאים נורמליים. טיפולים רבים או ישירות או עקיף לגרום ללחץ גנוטוקסינים בתאים סרטניים, אבל גם כמה להאריך בתאים נורמליים. כימותרפיה או תרופות ממוקדות משולבים לעתים קרובות עם הקרנות כדי לשפר את רגישות הרדיו של הגידול לקרינה,1,2,3,4,5, אשר מאפשר ירידה של את המינון הרדיואקטיבי כדי למזער את הנזק לרקמות נורמלי.
קרינה מייננת וסוכנים גנוסיים אחרים לגרום סוגים שונים של נזק לדנ א, כולל שינויי בסיס, מרובי סטרנד והפסקות יחיד או כפול סטרנד. DNA מעברי הגדיל כפול (DSBs) הם נגעים DNA החמורה ביותר האינדוקציה שלהם הוא המפתח להשפעה הריגת תאים של קרינה מייננת ותרופות ציטוסטטי שונים בכימותרפיה רדיותרפיה. Dsbs לא רק לפגוע ביושרה של הגנום, אלא גם לקדם את היווצרות של מוטציות6,7. לכן, מסלולים תיקון DSB שונים, מנגנונים לחסל תאים פגומים באופן חסר תקנה כמו אפופטוזיס פיתחו במהלך האבולוציה. התגובה הנזק DNA כולו (DDR) מוסדר על ידי רשת מורכבת של איתות מסלולים המגיעים מ-DNA זיהוי נזק ומחזור תא מעצר כדי לאפשר תיקון DNA, למות תאים מתוכנתים או הפעלה במקרה של כשל תיקון8.
שיטת הזרימה המוצגת של סייטוטומטנה פותחה כדי לחקור את ה-DDR לאחר הלחץ הגנומי באחת השיטות המקיפות שמכסה את האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם תוצאות כשל בתיקון. הוא משלב את המדידה של היישום הנרחב DSB סמן γH2AX עם ניתוח של מחזור התא אינדוקציה של אפופטוזיס, באמצעות ניתוח subG1 הקלאסי והערכה ספציפית יותר של caspase-3 הפעלה.
השילוב של נקודות קצה אלה באחד מה, לא רק מפחית את הזמן, העבודה והוצאות העלות, אלא גם מאפשר מדידה ספציפית של מחזור התא של האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם הפעלת caspase-3. ניתוחים כאלה לא יהיה אפשרי עם שנערך באופן עצמאי, אבל הם רלוונטיים מאוד להבנה מקיפה של התגובה נזק לדנ א לאחר הלחץ גנוטוקסיד. תרופות רבות נגד סרטן, כגון תרכובות ציטוסטטי, מכוונים נגד חלוקת תאים והיעילות שלהם תלויה מאוד בשלב מחזור התא. הזמינות של תהליכי תיקון dsb שונים תלויה גם בשלב מחזור התא ובחירת מסלול שהיא קריטית לדיוק התיקון, ובתורו קובע את גורלו של התא9,10,11, . שתיים עשרה בנוסף, מדידה ספציפית למחזור תאים של רמות DSB מדויקת יותר מניתוח במאגר, מכיוון שרמות DSB אינן תלויות רק במינון של תרכובת מגנטית או קרינה, אלא גם בתוכן הדנ א של התא.
השיטה שימש כדי להשוות את היעילות של רדיותרפיות שונות כדי להתגבר על מנגנוני ההתנגדות ב גלינובלסטומה13 ולנתח את הגומלין בין קרינה מייננת תרופות ממוקדות אוסטאוסרקומה14,15 וסרטן השרירים הטיפוסי... בנוסף, השיטה המתוארת שימש רבות כדי לנתח תופעות לוואי של רדיו-וכימותרפיה על תאי גזע mesenchymal17,18,19,20,21, 22,23,24, אשר חיוניים לתיקון של טיפול המושרה נזק רקמות נורמלי יש יישום פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1063">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">1000 &#181;L filter tips</td>
			<td style="width:151px;">Nerbe plus</td>
			<td style="width:169px;">07-693-8300</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:97px;">100-1000 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 &#181;m mesh pore size</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200 &#181;L filter tips</td>
			<td>Nerbe plus</td>
			<td>07-662-8300</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20-200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4&#8217;,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td style="width:339px;">Dissolve in water at 200 &#181;g/ml and store aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>613406</td>
			<td style="width:339px;">Dilute 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560626</td>
			<td style="width:339px;">Dilute 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BD FACSClean solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340345</td>
			<td style="width:339px;">For cytometer cleaning routine after measurement</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BD FACSRinse solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340346</td>
			<td style="width:339px;">For cytometer cleaning routine after measurement</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182</td>
			<td style="width:339px;">Dissolve in water to 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium with stable glutamin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td style="width:339px;">Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS Superior (fetal bovine serum)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S 0615</td>
			<td style="width:339px;">Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FlowJo v10 software</td>
			<td>LLC</td>
			<td>online order</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td style="width:339px;">Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">folded cellulose filters, grade 3hw</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>11416</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSRII or LSRFortessa cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MG132</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>474787</td>
			<td style="width:339px;">optional drug for apoptosis positive control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multifuge 3SR+</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3813</td>
			<td style="width:339px;">Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 &#176;C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&#174; 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#3475</td>
			<td style="width:339px;">Dilute 3:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPETBOY acu 2</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>155 016</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>AG-40T-0002-C020</td>
			<td style="width:339px;">optional drug for apoptosis positive control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T25 cell culture flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>690160</td>
			<td style="width:339px;">Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-025500</td>
			<td style="width:339px;">Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U87 MG glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC-HTB-14</td>
			<td style="width:339px;">Example cell line used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell cycle-specific measurement of &#947;h2ax and apoptosis after genotoxic stress by flow cytometry

השיטה המוצגת או גרסאות מעט שונה כבר המציאו ללמוד תגובות טיפול ספציפיות תופעות לוואי של טיפולים שונים נגד סרטן משמש אונקולוגיה קלינית. היא מאפשרת ניתוח כמותי ואורכי של התגובה נזק DNA לאחר הלחץ גנוטוקסי, כפי שנגרם על ידי הקרנות והמון תרופות נגד סרטן. השיטה מכסה את כל השלבים של תגובת ה-DNA התגובה, מתן נקודות קצה עבור אינדוקציה ותיקון של ה-DNA כפול הגדיל מעברי (DSBs), מעצר תא המעצר תא מוות על ידי אפופטוזיס במקרה של כשל בתיקון. שילוב מדידות אלה מספק מידע על השפעות הטיפול תלויי מחזור התא ובכך מאפשר מחקר מעמיק של הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני ההתמודדות נגד נזק לדנ א. כמו ההשפעה של מtherapeutics סרטן רבים כולל סוכני כימותרפיה וקרינה מייננת מוגבל או משתנה מאוד על פי שלבים ספציפיים מחזור התא, מנתח הקורקורונים להסתמך על שיטה חזקה והומה להעריך את השפעות הטיפול ב-DNA באופן ספציפי למחזור התא. דבר זה אינו אפשרי עם בחני נקודת קצה אחת ויתרון חשוב של השיטה המוצגת. השיטה אינה מוגבלת לקו תא מסוים ונבדק ביסודיות בהמון שורות של תאים סרטניים ורקמות רגילות. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב בתור שיטת הרעילות מקיפה בתחומים רבים של אונקולוגיה מלבד רדיו-אונקולוגיה, כולל גורם סיכון סביבתי הערכה, הקרנת סמים והערכה של אי-יציבות גנטית בתאי הגידול.

U87 אנושיים או LN229 התאים הגלינובללי היו לקרינה עם 4 Gy של פוטון או קרינת יון פחמן. מחזור תא ספציפי γH2AX רמות ו אפופטוזיס נמדדו בזמן נקודות שונות עד 48 h לאחר ההקרנה באמצעות שיטת הזרימה cy, הציג כאן (איור 3). בשני קווי התא, יוני פחמן המושרה גבוה יותר γH2AX השיא רמות שנדחו לאט יותר ונשארה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle-specific Measurement of Î³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry at JoVE.com

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

השיטה מספקת מידע על השפעות הטיפול תלוי מחזור התא ומאפשרת ולעומק מחקר של יחסי הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני התמודדות נגד נזק לדנ"א. שיטה זו משלבת נקודות קצה חשובות מתגובת הנזק לדנ"א כולל זיהוי ותיקון של שבירה כפולת גדילים, השפעות מחזור התאים, ובסופו של דבר מוות תאי על ידי אפופטוזיס לתוך בדיקה מקיפה אחת. השתמשנו בטכניקה זו בעיקר כדי לחקור תגובות טיפול ספציפיות ותופעות לוואי של טיפולים radiochemotherapeutic באונקולוגיה קלינית.ההתמדה שימושית מאוד למחקרים קואורלטיביים בתחומי הרדיוביולוגיה וההקרנות, אך ניתן ליישם אותה גם בתחומים שונים אחרים של אונקולוגיה. לאחר איסוף התאים מן התרבות על פי נהלי איסוף תאים סטנדרטיים, להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS. ולהעביר את התאים לשני מיליליטר של פתרון קיבעון בשכונה.לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו decant supernatant. חשוב לתקן את התאים כהשעיה של תא יחיד, ולשמור על זמן קיבוע קבוע עבור כל הדגימות. תן לתאים חסידים מספיק זמן להתנתק כדי להשיג תאים מעוגל יפה לניתוח.ואז לשחרר את גלולה על ידי הקשה מחדש של התאים בשלושה מיליליטר של 70% אתנול. כדי לשטוף את התאים לפני הכתם, לעים את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשחרר את גלולה על ידי הקשה. לאחר מכן בצעו שימוש חוזר בתאים עם שתי שטיפות רצופות עם שלושה מיליליטר של תות פתרון כביסה וכביסה אחת עם מיליליטר אחד של פתרון כביסה.השלכת העל-טבעי בין כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות שאפו את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור והתינו מחדש את גלולת הלוקנט ב-100 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה.לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה משוחררת ב 100 כדי 250 microliters של פתרון כתמי DNA ולחלק את התאים דרך מכסה מסננת התא של צינור מדגם עם גודל נקבובית רשת 35 מיקרומטר. כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את לשונית הפרמטרים בחלון הציטומטר ובחר את הפרמטרים כפי שצוין בטבלה. לאחר מכן, פתח את חלון גליון העבודה וצור התוויות כמצוין.טען דגימת בקרה על הציטרומטר ולחץ על לחצן הריצה. בחר את הצינור הראשון בחלון הדפדפן ולחץ על שם הצינור. כוונן את מתחי הגלאי עבור פיזור קדימה וצד ו- DAPI בכרטיסייה parameters של חלון המפקח.לחץ על לחצן המתנה כדי להמשיך בהגדרת גליון העבודה בתוכנה. השתמש בכלי שער מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים באזור פיזור קדימה לעומת ההתוויה של אזור פיזור הצד ולהשתמש בכלי שער המלבן כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים הבודדים ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת. לחץ על Control G כדי להציג את הירארכיית האוכלוסיה ולחץ על שמות השערים המוגדרים כברירת מחדל כדי לשנות את שמם.לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל ההיסטוגרמות כדי לבחור אוכלוסיות תצוגה ותאים בודדים מתפריט ההקשר. לרכוש דגימות בקרה וטופלו כדי לייעל את מתחי הגלאי עבור פלואורופורים מרוכזים בנוגדנים כדי לכסות את הטווח הדינמי המלא של האות. כדי למדוד את הדגימות, לחץ על לחצן ההפעלה בציטומטר ולהשתמש בלוח המחוונים של הרכישה בתוכנה כדי למדוד את הדגימות.לאחר מכן בחר קובץ, ייצוא וניסויים לבחירת ייצוא ספריות בתיבת הדו-שיח כדי לשמור את הנתונים כקבצי FCS נקודה. כדי להעריך את הנתונים, גרור ושחרר את קבצי FCS של הנקודה בדפדפן לדוגמה של תוכנת הניתוח הציטומטרי של הזרימה. ולהשתמש בכלי מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים בחלקת אזור פיזור קדימה לעומת צד ולהוציא פסולת מהניתוח.ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת, השתמש בכלי המלבן כדי להגדיר את האוכלוסיה של תאים בודדים ולא לכלול כפילויות או גושים של תאים מהניתוח. בהיסטוגרמה של אזור DAPI, השתמש בכלי ביסקטור כדי להבחין בין תאים בודדים עם תוכן דנ"א רגיל לתאי אפופוטוטיקה עם דנ"א מושפל. בחר ביולוגיה של כלי ומחזור תאים כדי לפתוח את כלי מידול מחזור התא ובחר דין-ג'ט פוקס כדי להעריך את תדירות התאים בשלבי G אחד S ו- G שני M.צור G אחד S ו- G שני ו- M שערי שלב ב DAPI עם התוויית אזור לעומת DAPI של אוכלוסיית מחזור התא כדי לאפשר מחזור תא ספציפי גמא H שתי מדידת A X. השתמש בכלי bisector כדי להבחין בין phosphohistone H שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה של אזור Alexa 555 של אוכלוסיית מחזור התאים ולהבחין CAS בסיס שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה אזור Alexa 647 של אוכלוסיית התאים הבודדים. הקש Control T כדי לפתוח את עורך הטבלאות ולקבוע את תצורת הטבלה כפי שצוין.לאחר מכן בחר באפשרות אל קובץ כדי להגדיר את התבנית והיעד במקטע הפלט של רצועת הכלים של התפריט ולייצא את הנתונים לגיליון כפולה. ions פחמן לגרום גמא גבוהה יותר H שתי רמות שיא AX בתאי גליובלסטומה לרדת לאט יותר ולהישאר גבוה באופן משמעותי ב 24 עד 48 שעות לעומת קרינת פוטון באותה מנה פיזית. עבור שני ions פחמן קרינת פוטון, גמא H שתי רמות AX היו הגבוהים ביותר בתאי שלב G אחד סביר כי תיקון שבירת גדיל כפול DNA מוגבל המסלול של סוף לא הומולוגי מצטרף בשלב זה במחזור התא.בקנה אחד עם קצב אינדוקציה לשבור גדיל כפול גבוה יותר קינטיקה תיקון איטי יותר, יון פחמן לגרום מעצר מחזור תא חזק יותר וארוכת טווח ב G שני שלב וקצב גבוה יותר של אפופטוזיס מאשר לעשות פוטונים. בהתאם לעוצמת אפקט הטיפול, הרזולוציה של שלבי מחזור התא השונים יכולה להיות מאתגרת. בשורות תאים מסוימות, לריכוז DAPI יש השפעה גדולה על איכות פרופיל מחזור התא ויש להתאים אותו.שקופיות ניתן להכין מן הדגימות הנותרות לאחר ציטומטריית זרימה כדי להעריך את המספר, גודל, ואת הצורה של גמא H שני מוקדי AX ולהבחין בין מוקד פרנוקלארי גמא H שני AX כתמים. בשיטה שלנו, אנו יכולים להראות כי תאי גזע mesenchymal עמידים יחסית נגד קרינה מייננת עיכוב topoisomerase אבל רגיש גליומיאצין. כמו אדי PFA רעילים, תמיד להשתמש מכסה המנוע אדים בעת הכנת פתרון הקיבעון במהלך שלב הקיבעון.זכור גם ללבוש כפפות בעת טיפול DAPI.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...