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August 18th, 2019
DOI :
August 18th, 2019
•0:04
Title
1:08
Growth of P. andersonii Trees
3:14
Stable transformation of P. andersonii
6:40
Preparation of Rooted P. andersonii Plantlets
7:31
Nodulation of P. andersonii Plantlets in Pots
9:48
Results: Stable Transformation Procedure
11:13
Conclusion
Transcript
पैरास्पोनिया कैनबिस परिवार से एक उष्णकटिबंधीय पेड़ है जो राइजोबायम के साथ नाइट्रोजन-फिक्सिंग सिम्बायोसिस स्थापित करने में सक्षम है। पैरास्पोनिया और फलियां के बीच तुलनात्मक अध्ययन राइजोबायम सिम्बायोसिस अंतर्निहित कोर आनुवंशिक नेटवर्क में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, पैरास्पोनिया एंडरसनी स्थिर ट्रांसजेनिक उत्परिवर्ती लाइनें दो से तीन महीने की अवधि में उत्पन्न की जा सकती हैं।
इन विट्रो प्रचार-प्रसार के माध्यम से इन पंक्तियों का कुशलतापूर्वक प्रचार किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल राइजोबियल सिम्बायोसिस के साथ-साथ इस उष्णकटिबंधीय पेड़ के जीव विज्ञान के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है। ऊतक संस्कृति और आणविक क्लोनिंग में बुनियादी कौशल इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए पर्याप्त हैं।
यह किसी भी प्रयोगशाला को पैरास्पोनिया को अनुसंधान मॉडल के रूप में अनुकूलित करने की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन पीएचडी छात्रों टिटिस वर्धानी और युडा रोसवानजया एक साथ Marijke Hartog, हमारी प्रयोगशाला में एक तकनीशियन के साथ होगा । पैरास्पोनिया एंडरसनी पेड़ उगाने के लिए, बीज अंकुरित करके शुरू करें।
एक चाय छलनी के अंदर के खिलाफ रगड़ या ऊतक कागज के एक टुकड़े पर उन्हें स्क्वैशिंग द्वारा पैरास्पोनिया जामुन से बीज निकालें। 15 से 20 मिनट के लिए 4% हाइपोक्लोराइट ब्लीच का उपयोग करके कीटाणुरहित बीज, और फिर बंध्याकरण वाले पानी से छह बार बीज धोएं। बीजों को बाँझ 200 माइक्रोलीटर पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और बीजों को जलमग्न करने के लिए नलियों को निष्फल पानी से भरें।
पांडुलिपि के निर्देशों के अनुसार थर्मोसाइकिलर में 10 दिनों के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। 10 दिन के इनक्यूबेशन के बाद, बीजों को एसएच-0 प्लेटों में स्थानांतरित करें, और उन्हें सुखाने से रोकने के लिए लोचदार सीलिंग पन्नी की दो परतों के साथ बंद करें। तीन से चार सप्ताह के लिए 16 घंटे के दिन, आठ घंटे रात चक्र के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
एक बार जब रोपण सच्ची पत्तियों का अपना पहला सेट विकसित कर लेते हैं, तो उन्हें वाणिज्यिक पॉटिंग मिट्टी से भरे बर्तनों में स्थानांतरित करें, और उन्हें एक पारदर्शी प्लास्टिक कप के साथ कवर करें ताकि उन्हें आनंद को रोका जा सके। बर्तन को 28 डिग्री सेल्सियस, ८५% सापेक्ष आर्द्रता जलवायु कक्ष या ग्रीनहाउस में 16 घंटे के दिन, आठ घंटे की रात के आहार के तहत रखें । एक सप्ताह के बाद प्लास्टिक कप निकाल लें।
नियमित रूप से बर्तन पानी, और पेड़ के विकास को बनाए रखने के लिए उर्वरक के साथ पूरक । ग्रीनहाउस उगाए गए पेड़ों से युवा पांच से आठ सेंटीमीटर शाखाओं की कटाई करके परिवर्तन के लिए तैयार करें, जिससे केवल स्वस्थ, गैर-संक्रमित शाखाओं का उपयोग करना सुनिश्चित किया जा सके। पत्तियों को काट लें, प्रत्येक पेटियोल के अंत में पत्ती के ऊतकों के एक सेंटीमीटर चुकता छोड़ दें।
पॉलीसोर्बेट 20 की कुछ बूंदों वाले 2% हाइपोक्लोराइट ब्लीच के साथ 15 मिनट के लिए ऊतक को कीटाणुरहित करें, और फिर इसे ऑटोक्लेवित पानी के साथ आठ बार कुल्ला करें। घुसपैठ माध्यम के 25 मिलीलीटर में एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं को लगभग पांच के ऑप्टिकल घनत्व के लिए फिर से निलंबित करें । स्टेम और पेटियोल ऊतक को सेल निलंबन के अंदर एक सेंटीमीटर के टुकड़ों में काट लें।
पत्ती के ऊतकों को निकालें और 10 से 30 मिनट के लिए सेल निलंबन में स्टेम और पेटियोल टुकड़ों को इनक्यूबेट करें। फिल्टर पेपर के एक बाँझ टुकड़े पर ऊतकों के टुकड़े सूखी और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार तैयार मध्यम पक्ष पर उन्हें जगह है। दो दिन तक अंधेरे में प्लेटों को 21 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
दो दिनों के बाद, फंगल या बैक्टीरियल संदूषण के लिए प्लेटों का निरीक्षण करें और दूषित प्लेटों को त्यागें। ऊतक के टुकड़ों को पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार तैयार एसएच-10 माध्यम के 10 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें। ऊतक को कम से कम 10 मिनट के लिए माध्यम में छोड़ दें, और धोने के लिए हर दो से तीन मिनट में धीरे से उत्तेजित करें।
पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार सेफोटैक्सिम और कानमाइसिन के साथ पक्ष माध्यम तैयार करें, और प्लेटें डालें। फिल्टर पेपर के बाँझ टुकड़ों पर ऊतकों को सुखाएं, और उन्हें प्लेटों में स्थानांतरित करें। 16 घंटे, आठ घंटे की रात के आहार के तहत 28 डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए इनक्यूबेट प्लेटें ।
हर दो दिन में फंगल या बैक्टीरियल संदूषण के लिए प्लेटों की जांच करें। यदि संदूषण होता है, तो गैर संक्रमित ऊतक के टुकड़ों को एक ताजा प्लेट में स्थानांतरित करें। सात दिनों के बाद, ऊतक के टुकड़ों को पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार तैयार किए गए प्रचार माध्यम में स्थानांतरित करें और 16 घंटे, आठ घंटे की रात के आहार के तहत 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
सप्ताह में एक बार प्लेटों को ताज़ा करें जब तक कि ट्रांसजेनिक शूट विकसित न हो जाए, जिससे केवल गैर-संक्रमित ऊतक टुकड़ों को नई प्लेटों में स्थानांतरित करना सुनिश्चित हो। एक बार ख्यात ट्रांसजेनिक शूटिंग कम से कम एक सेंटीमीटर लंबी होती है, तो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रचार माध्यम में शूटिंग और संस्कृति को स्वतंत्र रूप से काट लें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि शूट स्वतंत्र ट्रांसफॉर्मेंट का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक एक्सप्लांट के प्रत्येक पक्ष से केवल एक ही शूट लें।
प्रचार माध्यम की एक ताजा थाली पर लगभग 10 शूटिंग रखकर ऊतक का प्रचार करें और लोचदार सीलिंग फॉयल की दो परतों के साथ प्लेट को बंद करें। एक 16 घंटे के दिन, आठ घंटे रात आहार के तहत 28 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों इनक्यूबेट, और हर चार सप्ताह में इस कदम को दोहराने । जब शूटिंग लंबाई में एक सेंटीमीटर तक पहुंच जाती है, तो उन्हें अपने आधार पर काट लें और उन्हें पक्ष माध्यम पर रखें।
शूट के बेसल टिप को माध्यम में डालकर सीधे शूट की स्थिति करें। एक ही प्लेट पर लगभग 10 शूट रखे जा सकते हैं। राइजोबियम इनोकुलम तैयार करके शुरू करें।
मेसोरहिज़ोबियम प्लुरिफरियम बोर2 की एक कॉलोनी से तरल YEM माध्यम के 10 मिलीलीटर टीका, और दो दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । तरल YEM माध्यम की एक बड़ी मात्रा टीका लगाने के लिए इस संस्कृति का उपयोग करें। एक बार बड़े होने के बाद, कोशिकाओं को फसल करने के लिए 3, 500 गुना ग्राम पर 10 मिनट के लिए जीवाणु संस्कृति को अपकेंद्रित्र करें।
तरल ईकेएम माध्यम में बैक्टीरियल गोली को फिर से निलंबित करें, और ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करें। ईकेएम माध्यम के तीन लीटर तैयार करें, जो लगभग 20 बर्तनों के लिए पर्याप्त है, और इसे राइजोबियल निलंबन के साथ टीका लगाता है। माध्यम को 1.25 किलोग्राम पेलाइट के साथ मिलाएं, और बाँझ पारदर्शी पॉलीप्रोपाइलीन बर्तन में इस मिश्रण का 210 ग्राम जोड़ें।
प्रत्येक बर्तन में एक से तीन पैरास्पोनिया एंडरसनी प्लांटलेट्स लगाएं, और नियंत्रण निर्माण के साथ बदल गए प्लांटलेट्स के साथ कई बर्तन तैयार करें। बर्तन के कई वजन, और प्रकाश जोखिम से जड़ों को ढाल करने के लिए प्रत्येक बर्तन के नीचे कवर । चार से छह सप्ताह के लिए आठ घंटे की रात के आहार के तहत 28 डिग्री सेल्सियस पर एक जलवायु विकास कक्ष में बर्तन इनक्यूबेट ।
सप्ताह में एक बार, पानी के नुकसान को निर्धारित करने के लिए कई बर्तनों का वजन करें। यदि पानी की हानि 10 मिलीलीटर से अधिक है, तो नुकसान की भरपाई के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ पूरक करें। इनक्यूबेशन के बाद, परलाइट से जड़ों को साफ करें, और दूरबीन का उपयोग करके नोड्यूल नंबर निर्धारित करें।
इस तकनीक का उपयोग एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन एजीएल 1 के साथ पेटिओल्स और पैरास्पोनिया एंडरसनी के खंडों को सफलतापूर्वक बदलने के लिए किया गया है। सबसे पहले, ऊतक एक्सप्लांट्स को दो दिनों के लिए एग्रोबैक्टीरियम के साथ सह-खेती की जाती है। लंबे समय तक सह-खेती के परिणामस्वरूप बैक्टीरियल ओवर-उपनिवेशीकरण होता है और इसे रोका जाना चाहिए।
कुछ हफ्तों बाद, मूल घाव की सतह के साथ छोटे हरे रंग की माइक्रो-कैली देखी जाती हैं। ये कैली परिवर्तन की शुरुआत के बाद छह से आठ सप्ताह में एक या एक से अधिक ख्यात रूप से परिवर्तित शूटिंग को विकसित और विकसित करना जारी रखते हैं। युवा और तेजी से बढ़ती शाखाओं से ऊतक explants के लिए परिपक्व शाखाओं से ऊतक explants के लिए परिवर्तन क्षमता 10 से 30% से 65 से 75% तक भिन्न होती है।
ट्रांसजेनिक शूटिंग को इन विट्रो प्रचार के माध्यम से गुणा किया जा सकता है, जो एक महीने के भीतर दसियों शूटिंग को जन्म देता है। इन शूटिंग को पक्ष माध्यम पर रखा जा सकता है जो लगभग दो सप्ताह में रूट गठन को प्रेरित करेगा और पौधों को उत्पन्न करेगा जिनका उपयोग प्रयोग के लिए किया जा सकता है। एक स्थिर परिवर्तन प्रयोग शुरू करते समय, स्रोत सामग्री के रूप में स्वस्थ शाखाओं का चयन करना महत्वपूर्ण है।
पैरास्पोनिया टी0 ट्रांसजेनिक लाइनों को विट्रो में प्रचारित किया जाता है। इसलिए, पैरास्पोनिया ट्रांसजेनिक लाइनों को अच्छी तरह से जीनोटाइप करना आवश्यक है। एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में पैरास्पोनिया की स्थापना दो दूर से संबंधित नोड्यूलिंग वंश, पैरास्पोनिया और फलियां के बीच तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है।
यह राइजोबायम सिम्बायोसिस अंतर्निहित आनुवंशिक नेटवर्क के संरक्षण की पहचान कर सकता है । पैरासोनिया अन्य शोध विषयों जैसे लकड़ी के गठन, उभयलिंगी फूलों के विकास, या कैनाबैसी-विशिष्ट माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के बायोसिंथेसिस का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल भी हो सकता है।
पैरास्पोनिया एंडरसनी एक तेजी से बढ़ते उष्णकटिबंधीय पेड़ है जो कैनबिस परिवार (कैनाबेसी) से संबंधित है और राइजोबियम के सहयोग से नाइट्रोजन-फिक्सिंग रूट नोड्यूल बना सकता है। यहाँ, हम पी एंडरसनी में रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन Agrobacterium tumefaciensपर आधारित -मध्यस्थ स्थिर परिवर्तन और CRISPR/Cas9 आधारित जीनोम संपादन.
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