파라스포니아는 대마초 가족의 열대 나무로, 리조비움으로 질소 고정 공생을 확립 할 수 있습니다. 파라스포니아와 콩류 사이의 비교 연구는 rhizobium 심바이오시스의 기본 핵심 유전 네트워크에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해, 파라스포니아 앤더슨II 안정적인 형질전환 돌연변이 선은 2~3개월의 기간동안 생성될 수 있다.
이러한 선은 시험관 내 전파를 통해 효율적으로 전파될 수 있습니다. 이 프로토콜은 이 열대 나무의 생물학의 다른 측면뿐만 아니라 rhizobial 공생뿐만 아니라 연구하는 실험 플랫폼을 제공합니다. 조직 배양 및 분자 복제의 기본 기술은이 프로토콜을 구현하기에 충분합니다.
이를 통해 모든 실험실에서 Parasponia를 연구 모델로 조정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 티티스 워드니와 유다 로스완자야와 함께 우리 연구소의 기술자 인 마리즈케 하토그와 함께 할 것입니다. 파라스포니아 앤더슨이 나무를 성장하려면 씨앗을 발아하는 것으로 시작하십시오.
파라스포니아 베리에서 씨앗을 제거하여 차 체 안쪽을 문지르거나 티슈 페이퍼에 스쿼시하여 제거하십시오. 15~20분 동안 4%의 하이포염소표백제를 사용하여 씨앗을 소독한 다음, 멸균된 물로 씨앗을 6번 세척합니다. 씨앗을 200 마이크로리터 PCR 튜브를 멸균하고 튜브를 멸균물로 채우고 씨앗을 침수합니다.
원고 의 지시에 따라 열 순환기에서 10 일 동안 튜브를 배양하십시오. 10일 배양 후 씨앗을 SH-0 플레이트로 옮기고, 건조를 방지하기 위해 탄성 밀봉 호일 2층으로 닫습니다. 섭씨 28도에서 16시간, 8시간 1박 주기로 3~4주 동안 배양합니다.
모종들이 첫 번째 진정한 잎 세트를 개발하면 상업용 포팅 토양으로 채워진 냄비로 옮기고 반투명 플라스틱 컵으로 덮어 탈수를 방지합니다. 냄비는 섭씨 28도, 상대 습도 85% 또는 온실을 16시간, 8시간 야간 처방에 놓습니다. 1 주일 후, 플라스틱 컵을 제거합니다.
정기적으로 냄비에 물을, 나무 성장을 유지하기 위해 비료로 보충. 온실에서 자란 나무에서 5~8센티미터의 젊은 가지를 수확하여 건강하고 감염되지 않은 가지만 사용하도록 하여 변화를 준비하십시오. 잎을 잘라 각 쁘띠올 끝에 잎 조직의 1 센티미터 제곱을 떠나.
폴리소르바테 20방울을 함유한 2%의 하이포염소산 표백제로 15분 동안 조직을 소독한 다음, 오토클레이브 물로 8회 헹구는 다슈염소표백제. 침투 배지의 25 밀리리터에서 약 5의 광학 밀도로 아그로박테리움 세포를 재중단한다. 줄기와 쁘띠올 조직을 세포 현탁액 내부의 1센티미터 조각으로 자른다.
잎 조직을 제거하고 10~30분 동안 세포 현탁액의 줄기와 쁘띠올 조각을 배양합니다. 멸균 된 필터 용지에 조직 조각을 건조하고 원고 의 지시에 따라 준비 된 응원 매체에 배치합니다. 이틀 동안 21도에서 어둠 속에서 접시를 배양하십시오.
이틀 후, 곰팡이 또는 세균 오염을 위해 접시를 검사하고 오염 된 접시를 폐기하십시오. 원고 방향에 따라 제조된 SH-10 배지의 10 밀리리터로 조직 조각을 전달한다. 조직을 배지에 10분 이상 방치하고 2~3분마다 부드럽게 교반하여 씻습니다.
원고 의 지시에 따라 세포taxime와 카나마이신으로 응원 매체를 준비하고 접시를 붓습니다. 필터 용지의 멸균 조각에 조직을 건조하고 접시에 전송합니다. 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도에서 7일간 접시를 배양합니다.
이틀마다 곰팡이 또는 세균 오염을 위해 플레이트를 확인하십시오. 오염이 발생하면 감염되지 않은 조직 조각을 신선한 접시로 옮깁니다. 7 일 후, 원고 방향에 따라 준비 된 전파 매체에 조직 조각을 전송하고 16 시간, 8 시간 밤 처방에서 섭씨 28도에서 배양.
트랜스제닉 싹이 발생할 때까지 일주일에 한 번 플레이트를 새로 고치며 감염되지 않은 조직 조각만 새로운 플레이트로 옮기십시오. 일단 putative 형질 전환기 촬영은 적어도 1 센티미터 길이, 항생제와 전파 매체에서 독립적으로 싹과 배양을 잘라. 촬영이 독립적인 변혁을 나타내도록 하려면 각 쪽에서 단 한 번의 촬영만 하면 됩니다.
약 10개의 싹을 전파 매체의 신선한 접시에 놓고 탄성 밀봉 호일 의 두 층으로 접시를 닫음으로써 조직을 전파한다. 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도에서 접시를 배양하고 4주마다 이 단계를 반복합니다. 촬영이 길이1센티미터에 도달하면 베이스에 자르고 응원 매체에 놓습니다.
촬영의 기저 끝을 매체에 삽입하여 촬영을 똑바로 세워 놓습니다. 한 접시에 약 10개의 촬영이 가능합니다. 리코비움 접종을 준비하여 시작합니다.
메소리조비움 plurifarium BOR2의 단일 식민지에서 액체 YEM 배지의 10 밀리리터를 접종하고, 이틀 동안 섭씨 28도에서 배양. 이 배양을 사용하여 더 많은 양의 액체 YEM 배지를 접종하십시오. 일단 재배되면 박테리아 배양을 3, 500 배에서 10 분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.
액체 EKM 배지에서 세균 펠릿을 다시 중단하고 광학 밀도를 결정합니다. 약 20 개의 냄비에 충분한 EKM 배지 3 리터를 준비하고 rhizobial 서스펜션으로 접종하십시오. 매체를 1.25킬로그램의 펄라이트와 섞고, 이 혼합물210그램을 첨가하여 반투명 폴리프로필렌 냄비를 멸균합니다.
각 냄비에 1~3개의 파라스포니아 앤더슨ii 화분을 심고, 제어 구조로 변형된 화분으로 여러 냄비를 준비한다. 냄비의 몇 가지 무게, 빛 노출에서 뿌리를 보호하기 위해 각 냄비의 바닥을 커버. 4~6주 동안 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도의 기후성장실에서 냄비를 배양합니다.
일주일에 한 번, 물 손실을 결정하기 위해 여러 냄비의 무게. 물 손실이 10 밀리리터를 초과하는 경우, 손실을 보상하기 위해 초순수물로 보충하십시오. 인큐베이션 후, 펄라이트에서 뿌리를 청소하고 쌍안경을 사용하여 결절 번호를 결정합니다.
이 기술은 성공적으로 Agrobacterium 균주 AGL1와 파라스포니아 앤더슨의 petioles 및 세그먼트를 변환하는 데 사용되었습니다. 첫째, 조직 이출은 2 일 동안 아그로 박테리움과 공동 재배된다. 장기간의 공동 재배는 세균과 식민지화를 초래하며 예방해야 합니다.
몇 주 후, 작은 녹색 마이크로 칼리는 원래의 상처 표면을 따라 관찰된다. 이 칼리는 변화의 시작 후 6 ~ 8 주에 하나 이상의 putatively 변환 촬영을 성장하고 개발하고 있습니다. 변형 효율성은 젊고 빠르게 성장하는 지점에서 조직 이출을 위해 성숙한 가지에서 65 에서 75%까지 조직 이식에 대한 10에서 30 %까지 다양합니다.
트랜스제닉 촬영은 시험관 내 전파를 통해 곱할 수 있으며, 이는 한 달 이내에 수십 개의 촬영을 유발합니다. 이러한 촬영은 약 2주 안에 뿌리 형성을 유도하고 실험에 사용될 수 있는 식물을 산출하는 뿌리 매질에 배치될 수 있다. 안정적인 변환 실험을 시작할 때는 건강한 분기를 소스 재료로 선택하는 것이 중요합니다.
파라스포니아 T0 형질전환선은 시험관내에서 전파된다. 따라서, 철저하게 유전자형 파라스포니아 형선에 필수적이다. 실험 모델로 파라스포니아를 설립하면 두 개의 먼 관련 결속 계보, 파라스포니아 및 콩류 사이의 비교 분석을 가능하게 합니다.
이것은 rhizobium 심바이오시스의 근본적인 유전 네트워크를 보존하는 것을 확인할 수 있었습니다. 파라스포니아는 또한 목재 형성, 양성애자 꽃의 발달 또는 칸나비아아에 특이적 이차 대사산물의 생합성과 같은 다른 연구 주제를 연구하는 귀중한 모델이 될 수 있습니다.
