12.3K Views
•
12:22 min
•
August 18th, 2019
DOI :
August 18th, 2019
•0:04
Title
1:08
Growth of P. andersonii Trees
3:14
Stable transformation of P. andersonii
6:40
Preparation of Rooted P. andersonii Plantlets
7:31
Nodulation of P. andersonii Plantlets in Pots
9:48
Results: Stable Transformation Procedure
11:13
Conclusion
Transcript
Параспония является тропическим деревом из семьи каннабиса, который способен установить азотфиксации симбиоза с ризобием. Сравнительные исследования между Параспонией и бобовых могут дать представление о основных генетических сетях, лежащих в основе симбиоза ризобия. С помощью этого протокола, Parasponia andersonii стабильные трансгенные линии мутантов могут быть созданы в течение двух-трех месяцев.
Эти линии могут эффективно распространяться через распространение in vitro. Этот протокол предоставляет экспериментальную платформу для изучения ризобиального симбиоза, а также других аспектов биологии этого тропического дерева. Для реализации этого протокола достаточно базовых навыков в области культуры тканей и молекулярного клонирования.
Это позволяет любой лаборатории адаптировать Parasponia в качестве исследовательской модели. Демонстрация процедуры будет аспирантов Титис Wardhani и Yuda Roswanjaya вместе с Marijke Hartog, техник в нашей лаборатории. Чтобы вырастить деревья Parasponia andersonii, начните с прорастания семян.
Удалите семена из ягод Параспонии, потирая на внутренней стороне сито чая или давя их на листе бумаги. Дезинфицировать семена с помощью 4%гипохлорита отбеливатель в течение 15 до 20 минут, а затем мыть семена шесть раз с стерилизованной водой. Перенесите семена в стерильные 200 микролитровЫх ПЦР-трубок и заполните трубки стерилизованной водой, чтобы погрузить семена.
Инкубировать трубки в течение 10 дней в термоциклер в соответствии с рукописными указаниями. После 10-дневной инкубации перенесите семена на пластины SH-0 и закройте их двумя слоями эластичной уплотнительной фольги, чтобы предотвратить высыхание. Инкубация при 28 градусах по Цельсию с 16-часовым дневным восьмичасовым циклом в течение трех-четырех недель.
Как только саженцы разовьют свой первый набор истинных листьев, перенесите их в горшки, заполненные коммерческой почвой для заливки, и накройте их полупрозрачным пластиковым стаканчиком, чтобы предотвратить высыхание. Поместите горшки в 28-градусный по Цельсию, 85% относительной влажности климата комнате или теплице под 16-часовой день, восемь часов ночи режима. Через неделю снимите пластиковый стаканчик.
Регулярно поливать горшки, и дополнить удобрениями для поддержания роста деревьев. Подготовка к преобразованию путем сбора молодых пяти-восьми сантиметров ветви из тепличных деревьев, убедившись, что использовать только здоровые, неинфицированные ветви. Отрежьте листья, оставляя один сантиметр в квадрате листовой ткани в конце каждого петиола.
Дезинфицировать ткань в течение 15 минут с 2%гипохлорит отбеливатель, содержащий несколько капель полисорбата 20, а затем промыть его восемь раз с автоклавной водой. Повторно приостановить Agrobacterium клеток в 25 миллилитров инфильтрации среды до оптической плотности около пяти. Разрежьте стебель и ткань петиола на односемейные кусочки внутри клеточной подвески.
Удалите ткани листьев и инкубировать стволовые и петиол штук в клеточной суспензии в течение 10 до 30 минут. Высушите кусочки тканей на стерильном листе фильтровальной бумаги и поместите их на укореняющий носитель, подготовленный в соответствии с рукописными указаниями. Инкубировать пластины в темноте при 21 градусов по Цельсию в течение двух дней.
После двух дней, проверить пластины для грибкового или бактериального загрязнения и отказаться от загрязненных пластин. Перенесите кусочки ткани на 10 миллилитров среды SH-10, подготовленных в соответствии с рукописными указаниями. Оставьте ткань в среде, по крайней мере 10 минут, и осторожно агитировать каждые две-три минуты, чтобы вымыть.
Приготовьте укоренения среды с цефотаксимом и канамицином в соответствии с рукописными указаниями, и залейте пластинами. Высушите ткани на стерильных кусочках фильтровальной бумаги и перенесите их на тарелки. Инкубационые пластины в течение семи дней при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовым дневным, восьмичасовым режимом.
Проверяйте пластины на грибковое или бактериальное загрязнение каждые два дня. Если происходит загрязнение, перенесите неинфекционые части ткани на свежую тарелку. Через семь дней перенесите части ткани в среду распространения, подготовленную в соответствии с рукописными указаниями, и инкубировать при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовым режимом восьмичасовой ночи.
Освежите пластины один раз в неделю, пока трансгенные побеги развиваться, убедившись, что только передача неинфицированных частей ткани на новые пластины. После того, как мнимые трансгенные побеги, по крайней мере один сантиметр длиной, сократить побеги и культуры их самостоятельно в распространении среды с антибиотиками. Для того, чтобы побеги представляли собой независимые трансформанты, возьмите только один выстрел с каждой стороны explant.
Прораспространяй ткань, поместив около 10 побегов на свежую тарелку среды распространения и закрыв пластину двумя слоями эластичной уплотнительной фольги. Инкубировать пластины при 28 градусах по Цельсию в соответствии с 16-часовой день, восемь часов ночи режим, и повторить этот шаг каждые четыре недели. Когда побеги достигают одного сантиметра в длину, вырезать их у их основания и поместить их на укоренения среды.
Распоить побеги вертикально, вставив базальный кончик стрелять в среду. Около 10 побегов можно разместить на одной тарелке. Начните с подготовки ризобия inoculum.
Прививка 10 миллилитров жидкой среды YEM из одной колонии Mesorhizobium plurifarium BOR2, и инкубировать при 28 градусах по Цельсию в течение двух дней. Используйте эту культуру для прививки большего объема жидкой среды YEM. После того, как выросли, центрифуга бактериальной культуры в течение 10 минут при 3500 раз г для сбора клеток.
Повторно приостанавливайте бактериальные гранулы в жидкой среде EKM и определите оптическую плотность. Приготовьте три литра среды EKM, которых хватит примерно на 20 горшков, и прививки от корневой подвески. Смешайте среду с 1,25 кг перлита и добавьте 210 граммов этой смеси в стерильные полупрозрачные полипропиленовые горшки.
Завод от одного до трех Parasponia andersonii растения для каждого горшка, и подготовить несколько горшков с plantlets преобразованы с контрольной конструкцией. Взвесить несколько горшков, и покрыть дно каждого горшка, чтобы оградить корни от воздействия света. Инкубировать горшки в климатизированной комнате роста на 28 градусов по Цельсию в соответствии с 16-часовой день, восемь часов ночи режим в течение четырех-шести недель.
Раз в неделю, весят несколько горшков, чтобы определить потерю воды. Если потеря воды превышает 10 миллилитров, дополнить ультра-чистой водой, чтобы компенсировать потерю. После инкубации очистите корни от перлита и определите номера узлов с помощью бинокля.
Этот метод был использован для успешного преобразования петиол и сегментов Parasponia andersonii стебли с agrobacterium штамм AGL1. Во-первых, ткани explants совместно культивируются с Agrobacterium в течение двух дней. Длительное совместное культивирование приводит к чрезмерной колонизации бактерий и должно быть предотвращено.
Несколько недель спустя, небольшие зеленые микро-калли наблюдаются вдоль первоначальной поверхности раны. Эти калли продолжают расти и развивать один или несколько сшатимо преобразованных побегов в шесть-восемь недель после начала трансформации. Эффективность преобразования варьируется от 10 до 30% для тканевых эксплантов от зрелых ветвей до 65-75% для тканевых эксплантов из молодых и быстро растущих ветвей.
Трансгенные побеги можно умножить за счет распространения in vitro, что приводит к десяткам побегов в течение месяца. Эти побеги могут быть размещены на укоренения среды, которые будут вызывать образование корней примерно через две недели и урожайность растений, которые могут быть использованы для экспериментов. При запуске стабильного эксперимента по трансформации важно выбрать здоровые ветви в качестве исходного материала.
Параспония T0 трансгенных линий распространяются в пробирке. Поэтому необходимо тщательно генотипить трансгенных линий Параспонии. Создание Параспонии в качестве экспериментальной модели позволяет провести сравнительный анализ между двумя отдаленно связанными кинулирующими линиями, Параспонией и бобовых.
Это может определить сохранение генетических сетей, лежащих в основе симбиоза корневища. Параспония также может быть ценной моделью для изучения других тем исследований, таких как деревообразование, развитие бисексуальных цветов, или биосинтез Каннапаси конкретных вторичных метаболитов.
Parasponia andersonii является быстрорастущим тропическим деревом, которое принадлежит к семейств каннабиса (Cannabaceae) и может образовывать азотфиксирующие корневые узлы в связи с корневиком. Здесь мы описываем подробный протокол для обратного генетического анализа в P. andersonii на основе Agrobacteriumtumefaciens-опосредованной стабильной трансформации и редактирования генома на основе CRISPR/Cas9.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved