Name: quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر نيومان على المناقشات القيمة والمدخلات. وقدمت بعض السلالات من قبل CGC، التي تمولها مكتب المعاهد الوطنية للصحة من برامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). يشكر المؤلفون WormBase على ثروتها من المعلومات عن C. elegans، وينوه موناش التصوير الصغير ، جامعة موناش ، لتوفير الأجهزة والتدريب والدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية لـ CMTAA (2015 و2018)، ومنح مشروع NHMRC 1101974 و1099690 المقدمة إلى B.N.

1- نمو وصيانة سلالات C. elegans
<ol><li>بذور نيماتود النمو المتوسط (NGM، انظر جدولالمواد) لوحات أجار مع 300 درجة مئوية من سلالة القولونية بطيئة النمو OP50 في مجلس الوزراء تدفق اللامينار.</li>
	<li>اترك لوحات أجار NGM في خزانة تدفق اللامينار لتجف. ملاحظة: في غياب مجلس الوزراء تدفق laminar، لوح...

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li><li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation.">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li><li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo.">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li><li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues.">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+image+restoration+and+segmentation:+A+generalized+linear+model/bregman+perspective.">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li><li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh.">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li><li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase.">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li><li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration.">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li><li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation.">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li><li>Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17/&#945;TAT1.">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/&#945;TAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).</li><li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease.">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li><li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural,+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584 (2019).</li><li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission.">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li><li>Zhu, P. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1.">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li><li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff,+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li><li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells.">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li><li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution.">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li></ol>

وكثيرا ً ما يتم تقييم الاختلافات المورفولوجية من خلال العد اليدوي للاختلافات الملحوظة أو باستخدام عتبات تعسفية لتحديد العيوب مقارنة بالنمط الظاهري الظاهري. ولكن في الآونة الأخيرة، استخدمت أساليب كمية للدراسات المقارنة للمورفولوجيا لقياس التغيرات على مستوى الخلايا ودون الخلوية ووصفها ...

يستخدم على نحو متزايد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans (C. elegans) كنظام نموذجي للكشف عن العمليات البيولوجية والجزيئية التي تنطوي عليها الأمراض البشرية. الديدان الخيطية الكبار لديه طول الجسم من ما يزيد قليلا على 1 ملم، ويمكنأن تنتج الحضنة كبيرة تصل إلى 300 بيضة 1. بعد الفقس، C. elegans تتطلب فقط 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ، ويعيش لحوالي 2 إلى 3 أسابيع2. نظرا لسهولة الزراعة، C. elegans هو حاليا واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر رواجا في الجسم الحي لإجراء فحص فعال من حيث التكلفة والسريع للمخدرات لتحديد العلاجات للأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على الوراثة، والنماذج السلوكية المحددة جيدا، والجسم الشفاف للفلورة أو الفحص المجهري الخفيف، وسهولة التلاعب الجيني تجعل دراسة العواقب الخلوية والجزيئية للطفرات الوراثية قابلة لتحقيقها بسهولة 3. وC. elegans الجينوم يشارك ما يقرب من 60-80٪ علم الأنسجة مع الجينات البشرية، وحوالي 40٪ من تلك الجينات ومن المعروف أن تكون ذات صلة بالأمراض. بعض الأمراض البشرية التي تم نمذجة ودراسة في C. elegans تشمل الاضطرابات العصبية (مرض الزهايمر، مرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض شاركو ماري الأسنان)، الأمراض المرتبطة بالعضلات ( ضمور العضلات دوشين)، والأمراض الأيضية (فرط السكر في الدم)2،4. في معظم الاضطرابات البشرية، تحدث التعريب الخلوي والأعضاء الناجم عن الأمراض والتغيرات المورفولوجية، والتي يمكن تقييمها بسهولة في نموذج الديدان الخيطية.
وقد استخدمت علامات الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأنسجة والعضيات للتصور الديناميكي تحت المجهر. ومع ذلك، في C. elegans، اعتمدت الأساليب التقليدية التي تقيّم المخالفات المورفولوجية بسبب الطفرات الوراثية إلى حد كبير على الأوصاف البصرية. في حين أن التقييمات النوعية يمكن أن تغطي نطاقات أوسع من الأوصاف الفينوتية (مورفولوجيا متشابك، تكتل GFP، شكل بديهي محدد، سمك الألياف العضلية، وما إلى ذلك) وتوفير وجهة نظر الطيور العين من التغيرات المورفولوجية، فهي أقل ملاءمة لل مقارنة الاختلافات الصغيرة عبر مجموعات مختلفة. وعلاوة على ذلك، تستند التقييمات النوعية إلى تقييم بصري وذاتي، مما قد يؤدي إلى تقدير التشوهات المورفولوجية تقديرا ً مفرطاً أو ناقصاً. وأخيرا، يمكن أن تختلف الملاحظات النوعية أيضا اختلافا كبيرا بين الأفراد، مما يخلق صعوبات في تكرار البيانات.
وفي السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الخوارزميات الحسابية السهلة الاستعمال والمتاحة بسهولة التي يمكنأن تحلل الصور كميا. ومع ذلك، فإن استخدام مثل هذه البرمجيات تحليل الصور لبعض الدراسات المورفولوجية، وخاصة فيما يتعلق عضلات جدار الجسم والميتوكوندريا، في C. elegans البحوث قد تخلفت. لتحسين التحليل الهيكلي الأساسي في C. elegans, تم تجريب بعض من البرمجيات المتاحة بسهولة, تحليل الصور مفتوحة المصدر لمقارنة كمية آثار الطفرات الوراثية على الميتوكوندريا العضلات, عضلة جدار الجسم ومتشابك مورفولوجيا. هذه الإجراءات التجريبية الخطوط العريضة بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذه البرامج (فيجي، ilastik، CellProfiler، SQUASSH) لتقييم التغيرات في حجم متشابك وتوطين البروتين متشابك، منطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف، وحجم الميتوكوندريا وحجم الميتوكوندريا و التعميم نتيجة للطفرات الوراثية في الديدان الخيطية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01614.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Inverted platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Zeiss Axio Imager M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENCS22221GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1.5</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>Made by SCHOTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENS41104A/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (Peptone from casein)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107213</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Peptone from meat)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107214</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105101</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106586</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS7095D5X-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430589-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>267201-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Met-app</td>
			<td>2616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans

تحديد الآليات الخلوية الكامنة وراء المرض أمر ضروري لتطوير علاجات جديدة. وتتمثل الاستراتيجية التي كثيرا ما تستخدم لكشف هذه الآليات في إدخال طفرات في الجينات المرشحة ووصف التغيرات النوعية في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات الخلوية. ومع ذلك، قد لا تلتقط الأوصاف النوعية اختلافات فينوتيبيك خفية، وقد تشوه الاختلافات الفينوتية عبر الأفراد في مجموعة سكانية، وكثيراً ما يتم تقييمها ذاتياً. هنا، يتم وصف النهج الكمية لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans باستخدام المسح الضوئي بالليزر المجهرية البؤرية جنبا إلى جنب مع برامج معالجة الصور الحيوية المتاحة تجاريا. تم إجراء تحليل كمي للأنماط الظاهرية التي تؤثر على سلامة المشبك (الحجم ومستويات الفلورة المتكاملة)، وتنمية العضلات (حجم خلية العضلات وطول خيوط الميوسين)، ومورفولوجيا الميتوكوندريا (التعميم والحجم) لفهم آثار الطفرات الوراثية على هذه الهياكل الخلوية. ولا تقتصر هذه النُهج الكمية على التطبيقات الموصوفة هنا، حيث يمكن استخدامها بسهولة لتقييم شكل الأنسجة والعضيات الأخرى في الديدان الخيطية، وكذلك في الكائنات الحية النموذجية الأخرى.

C. elegans هو كائن نموذجي مثالي لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات المختلفة بسبب بساطته، والنسب الخلية المعروفة، والشفافية، والأدوات المتاحة. هنا، نحن نقدم النهج الكمية لدراسة العضيات (على سبيل المثال، الميتوكوندريا) والأنسجة، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي والعضلا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

المناهج الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا الأعضاء في الكنورهابدية

توضح هذه الدراسة القياسات الكمية لحجم متشابك والتعريب، ومورفولوجيا العضلات، وشكل الميتوكوندريا في C. elegans باستخدام أدوات معالجة الصور المتاحة بحرية. يسمح هذا النهج للدراسات المستقبلية في C. elegans بمقارنة كمية مدى التغيرات الهيكلية للأنسجة والأعضاء نتيجة للطفرات الوراثية.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

إن القدرة على قياس التغيرات في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات مهمة لفهم وظيفة الجينات وكذلك تأثير الطفرات الوراثية. بروتوكولاتنا شرح كيف يمكن استخدام البرمجيات المتاحة بحرية لتقييم غير ذاتي من مورفولوجيا نقاط الاشتباك العصبي والعضلات والميتوكوندريا في الخيطية، C.elegans. وقد اعتمدت العديد من الدراسات السابقة على أساليب نوعية لمقارنة التغيرات المورفولوجية.ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه إشكالية لأنها قد لا تلتقط الاختلافات الظاهرية خفية ، قد أكثر من والتقليل من شأن التغييرات ، ويتم تقييمها ذاتيا. توفر أساليبنا الكمية وسائل أكثر قوة وأقل تحيزًا لتقييم التغيرات المورفولوجية. ويمكن استخدام هذه الطرق بسهولة لدراسة التغيرات المورفولوجية في الهياكل الخلوية الأخرى أو الكائنات العضوية النموذجية من أجل تحديد وظيفة الجينات وعواقب الطفرات المرتبطة بالأمراض.ابدأ بإعداد الشرائح للتصوير. ضع قطرة من agarose الذائبة على شريحة المجهر واضغط على الفور أسفل القطرة مع شريحة مجهر أخرى ، وسوت بلطف agarose. ترك agarose لتجف لمدة دقيقة واحدة ثم فصل بعناية اثنين من الشرائح وترك لوحة صلبة على واحدة من الشرائح.ضع الشريحة على مرحلة المجهر وأضف قطرة مخدر من خمسة إلى 10 ملليلتر إلى مركز لوحة agarose. استخدام اختيار معقمة الحرارة لنقل بسرعة 10 إلى 15 الحيوانات من لوحة الأسهم إلى قطرات مخدر قبل أن يجف الحل. ثم تطبيق غطاء عن طريق وضعه فقط فوق لوحة agarose وإسقاط بلطف عليه.صورة المناطق متشابك مع خط المسح المجهر confocal إلى جانب 488 و 552 نانومتر بصريا ضخ ليزر شبه موصل الصمام الثنائي ومجهزة برنامج التقاط الصور. بعد تحديد موقع الديدان، انتقل إلى تكبير 40X وتطبيق وسط الغمر. البصرية المنطقة متشابك من قبل مثيرة fluorophores مع ليزر نانومتر 552، 1٪ قوة لفلوروفور tagRFP، و 488 نانومتر، 2٪ السلطة لفلوروفور GFP.التقاط الصور باستخدام الضوئي الهجين وتعيين المكاسب لمنع التعرض المفرط للفلوروفوريس. جمع الصور Z-المكدس لتغطية المشبك بأكمله باستخدام حجم الخطوة Z الأمثل اعتمادا على الهدف. لتحليل منطقة متشابك تبدأ عن طريق تحميل الصور في برنامج CellProfiler 3.1.5.قم بإعداد الوحدة النمطية NameAndType وتحديد المنطقة متشابك بواسطة تعريف جهة باستخدام tagRFP المنتشر التعبير عنها من transgene UIS-115. قياس حجم ومينوسنس من المشبك المعرفة يدويا عن طريق إضافة وحدات MeasureObjectSizeShape و MeasureObjectIntensity إلى خط الأنابيب. ثم حساب كثافة الفلوريسنس المتكاملة النسبية عن طريق إضافة وحدة حساب ماث وتقسيم وحدات الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من JSIS37 من قبل تلك التي تم الحصول عليها من UIS-115.عند الانتهاء من تصدير جميع القياسات والحسابات. لقياس منطقة خلايا العضلات فتح الصورة في فيجي البرمجيات واستخدام اختيار المضلع لتتبع بعناية حول خلية واحدة العضلات المائلة. اضبط خط المضلع في النهاية بسحب نقطة الإرساء لتحسين التتبع.انتقل إلى علامة التبويب تحليل في أعلى البرنامج وانقر على قياس لحساب المنطقة المحددة. بالنسبة لخلايا العضلات التي تحتوي على منطقة منحطة أو مفقودة، تتبع المنطقة المفقودة باستخدام أداة تحديد المضلع وانقر فوق قياس مرة أخرى. إذا كان هناك فجوات متعددة، تتبع كل واحد على حدة.حساب نسبة مساحة الفجوة إلى مساحة الخلية بأكملها. تشير نسبة عالية إلى ارتفاع درجة انحطاط العضلات. وإذا لم تكن هناك مناطق مفقودة، يتم حساب النسبة على أنها صفر.افتح Elastic واختر تصنيف بكسل ضمن إنشاء مشروع جديد. ثم إعادة تسمية وحفظ المشروع. انتقل إلى علامة التبويب بيانات الإدخال وانقر فوق إضافة جديد، ثم إضافة صور منفصلة.قم بتوجيه النافذة المنبثقة إلى المجلد باستخدام ملفات TIF وحدد الصورة المطلوبة. في علامة التبويب اختيار الميزة انقر فوق تحديد الميزات لتحديد كافة ميزات بكسل المشار إليها من قبل مربعات علامة الخضراء. يتم استخدام تحديد البكسل في هذه الخطوة لتمييز الفئات المختلفة من وحدات البكسل في الخطوة التالية.استخدام لوحة التدريب للتمييز بين خيوط myosin الفردية التي تعبر عن GFP والخلفية غير المرغوب فيها. انقر على إضافة تسمية والخربشة الخلفيات غير المرغوب فيها والمسافات بين خيوط لبدء التدريب المصنف. أضف تسمية ثانية، أعيد تسميتها إلى خيوط، وازحف على عدد من الخيوط.انقر على Live Update للتأكد من أن التصنيف قد تم بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من الخربشة لضبط التدريب. بمجرد أن يتم تنفيذ مصنف التدريب ، انتقل إلى لوحة تصدير التنبؤ وانقر على اختيار إعدادات صورة التصدير مع الاحتمالات كمصدر.تأكد من أن يتم تكتك المناطق الفرعية اقطع x و y، و ج غير مُغَرَّد. حدد صفرًا وقيمة واحدة كقيم بدء وإيقاف لـ c، وتحويل نوع البيانات إلى 8 بت غير موقعة. ضع علامة على إعادة صياغة ثم قم بتغيير ملف إخراج الفيديو إلى png، وإعادة تسمية الملف والدليل حسب الرغبة.أغلق نافذة تصدير الإعدادات ثم قم بتصدير الصورة التي تم تقسيمها للتو. ثم افتح ملف png في برنامج فيجي. اضبط الحد الأدنى للصورة باستخدام الإعدادات الافتراضية وقم بتطبيق المكون الإضافي للهيكل العظمي، والذي سينشئ جدولًا منفصلًا للنتائج.وقد استخدم هذا البروتوكول لاستكشاف وظيفة ألفا-توبولين أسيتيل ترانسفيراز MEC-17 في تطوير المشبك. التحليل الكمي لصور microtubule الخلفي / الجانبي أو نقاط الاشتباك العصبي PLM يشير إلى أن فرط التعبير من MEC-17 يعطل وظيفة الخلايا العصبية العادية. بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة على نوع البرية overexpressing MEC-17 قد خفضت بشكل كبير المناطق presynaptic والسلامة متشابك.وقد استخدمت هذه التقنيات أيضا لتحليل نماذج C.elegans من نوع شاركوت ماري توث 2 أو CMT2 تحمل الطفرات في الجينات المرتبطة CMT2. وكشف التقييم البصري لرفرف العضلات جدار الجسم زيادة 2.5 إلى 3.5 أضعاف في العيوب في الحيوانات اختبار بالمقارنة مع التحكم في نوع البرية. الحيوانات مع الطفرات في fzo-1 و unc-116 شهدت فقدان العضلات التصدع، وتراكم الحطام الخلوي، وانحطاط الألياف العضلية.في حين أن الحيوانات مع الطفرات في dyn-1 شهدت عيوب أقل بكثير في مورفولوجيا العضلات. وأظهرت المسوخ fzo-1 و unc-116 زيادة خمسة إلى ستة أضعاف في نسبة الفجوة إلى إجمالي منطقة الخلية المفردة ومتوسط متوسط طول الألياف بشكل كبير مقارنة بالحيوانات من النوع البري. لإجراء المقارنات بين العينات من المهم تحديد أفضل الظروف للحصول على الصورة، وضمان استخدام هذه الشروط بشكل متسق.وسوف تسمح هذه التقنيات للباحثين بمقارنة التغيرات المورفولوجية عبر خلفيات جينية مختلفة مع المقاربات الكمية. وهذا يقلل من الذاتية، وبالتالي يساعد على تعزيز قابلية تمثيل البيانات التي تم إنشاؤها.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

النمذجة العمر المرتبطة الأمراض العصبية في Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...