Name: quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório de Neumann por discussões e entradas valiosas. Algumas cepas foram fornecidas pela CGC, que é financiada pelo NIH Office de programas de infra-estrutura de pesquisa (P40 OD010440). Os autores agradecem à WormBase por sua riqueza de informações sobre C. elegans, e reconhecem a Monash micro Imaging, a Monash University, para o fornecimento de instrumentação, treinamento e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa da CMTAA (2015 e 2018), e o projeto NHMRC concede 1101974 e 1099690 concedidos à B.N.

1. crescimento e manutenção de cepas de C. elegans
<ol><li>Sementes de meio de crescimento de nematódeos (NGM, ver tabela de materiais) placas de agar com 300 μl da estirpe de E. coli de crescimento lento OP50 em um armário de fluxo laminar.</li>
	<li>Deixe as placas de agar NGM no gabinete de fluxo laminar para secar. Nota: na ausência de armário do fluxo laminar, as placas podem ser deixadas para secar no banco mas são mais propensas à contaminação.</li>
	<li>Transfira...

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li><li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation.">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li><li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo.">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li><li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues.">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ilastik:+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit.">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+image+restoration+and+segmentation:+A+generalized+linear+model/bregman+perspective.">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li><li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh.">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li><li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase.">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li><li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration.">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li><li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation.">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li><li>Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17/&#945;TAT1.">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/&#945;TAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).</li><li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease.">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li><li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural,+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans.">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584 (2019).</li><li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission.">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li><li>Zhu, P. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1.">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li><li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff,+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li><li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells.">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li><li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution.">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li></ol>

As variações morfológicas foram avaliadas freqüentemente através da contagem manual de diferenças visíveis ou de usar limiares arbitrários para determinar defeitos em comparação a um phenotype do selvagem-tipo. Mais recentemente, entretanto, os métodos quantitativos foram usados para estudos comparativos da morfologia para medir exatamente e descrever mudanças em um nível celular e subcellular em uma forma imparcial. A capacidade de identificar diferenças sutis e biologicamente relevantes entre os fenótipo...

O nematódeo Caenorhabditis elegans (C. elegans) é cada vez mais utilizado como um sistema modelo para desvendar os processos biológicos e moleculares envolvidos na doença humana. Um nematódeo adulto tem um comprimento de corpo de pouco mais de 1 mm, e pode produzir uma grande ninhada de até 300 ovos1. Após a eclosão, C. elegans só exigem 3-4 dias para atingir a idade adulta, e viver por cerca de 2 a 3 semanas2. Devido à sua facilidade de cultivo, C. elegans é atualmente um dos modelos animais mais procurados in vivo para a realização de triagem de drogas rentável e rápida para identificar terapêutica para doenças humanas. Adicionalmente, sua conservação genética, paradigmas comportáveis bem definidos, corpo transparente para a fluorescência ou a microscopia de luz, e a facilidade da manipulação genética fazem o estudo de conseqüências celulares e moleculars de mutações genéticas prontamente achieveable 3. o genoma C. elegans compartilha aproximadamente 60-80% de ortologia com genes humanos, e cerca de 40% desses genes são conhecidos como relacionados à doença. Algumas das doenças humanas que foram modeladas e estudadas em C. elegans incluem distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth), doenças associadas ao músculo ( Distrofia muscular de Duchenne) e doenças metabólicas (hiperglicemia)2,4. Na maioria dos distúrbios humanos, ocorre a localização celular e organela induzida por doenças e alterações morfológicas, que podem ser prontamente avaliadas no modelo de nematódeos.
Os marcadores fluorescentes têm sido amplamente utilizados para rotular tecidos e organelas para visualização dinâmica o microscópio. No entanto, em C. elegans, os métodos convencionais que avaliam as irregularidades morfológicas devido a mutações genéticas têm se invocado em grande parte nas descrições visuais. Embora as avaliações qualitativas possam abranger faixas mais amplas de descrições fenotípicas (morfologia sináptica, aglutinamento de GFP, forma axonal específica, espessura da fibra muscular, etc.) e proporcionam uma visão ocular das alterações morfológicas, elas são menos adequadas para comparando pequenas variações entre diferentes grupos. Além disso, as avaliações qualitativas são baseadas na avaliação visual, subjetiva, que pode conduzir a excesso ou subestimativas de anomalias morfológicas. Finalmente, as observações qualitativas também podem variar muito entre os indivíduos, criando dificuldades com a replicação de dados.
Nos últimos anos, um número de algoritmos computacionais de fácil utilização e prontamente disponíveis que podem analisar quantitativamente as imagens foram desenvolvidas. No entanto, a utilização de tal software de análise de imagem para alguns estudos morfológicos, especialmente em relação aos músculos da parede corporal e mitocôndria, em C. elegans Research tem se atrasado. Para melhorar a análise estrutural subjacente em C. elegans, algumas das prontamente disponíveis, software de análise de imagem de código aberto foram trialed para comparar quantitativamente os efeitos das mutações genéticas na mitocôndria muscular, músculo da parede do corpo e sináptica Morfologia. Estes procedimentos experimentais esboçam em detalhe como estes programas (Fiji, ilastik, cellprofiler, squassh) podem ser usados para avaliar mudanças no tamanho sináptica e na localização da proteína sináptica, na área do músculo da parede do corpo e no comprimento da fibra, e no tamanho mitochondrial e circularidade como resultado de mutações genéticas no nematoide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01614.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Inverted platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Zeiss Axio Imager M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENCS22221GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips #1.5</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>Made by SCHOTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo scientifique</td>
			<td>MENS41104A/40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>KL 300 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone (Peptone from casein)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107213</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Peptone from meat)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107214</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1296</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105101</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106586</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>Ingredients for M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS7095D5X-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430589-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>267201-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Met-app</td>
			<td>2616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative approaches for studying cellular structures and organelle morphology in caenorhabditis elegans

A definição dos mecanismos celulares subjacentes à doença é essencial para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Uma estratégia freqüentemente usada para desvendar esses mecanismos é introduzir mutações nos genes candidatos e descrever qualitativamente as alterações na morfologia dos tecidos e organelas celulares. Entretanto, as descrições qualitativas não podem capturar diferenças fenotípicas sutis, podem deturpar variações fenotípicas em indivíduos de uma população, e são freqüentemente avaliadas subjetivamente. Aqui, abordagens quantitativas são descritas para estudar a morfologia dos tecidos e organelas no nematódeo Caenorhabditis elegans usando microscopia confocal de varredura a laser combinada com software de processamento de bioimagem disponível comercialmente. Uma análise quantitativa de fenótipos que afetam a integridade da sinapse (tamanho e níveis de fluorescência integrados), desenvolvimento muscular (tamanho da célula muscular e comprimento do filamento da miosina) e morfologia mitocondrial (circularidade e tamanho) foi realizada para entender os efeitos das mutações genéticas nestas estruturas celulares. Essas abordagens quantitativas não se limitam às aplicações aqui descritas, pois poderiam prontamente ser utilizadas para avaliar quantitativamente a morfologia de outros tecidos e organelas no nematoide, bem como em outros organismos modelo.

C. elegans é um organismo modelo ideal para estudar a morfologia de diferentes tecidos e organelas devido à sua simplicidade, linhagem celular conhecida, transparência e ferramentas disponíveis. Aqui, nós fornecemos abordagens quantitativas para o estudo de organelas (por exemplo, mitocôndria) e tecidos, incluindo sinapses e músculos usando imagens de fluorescência ao vivo e software de processamento de bio imagem livre.
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Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

A capacidade de quantificar mudanças na morfologia de tecidos e organelas é importante para entender a função genética, bem como o impacto das mutações genéticas. Nossos protocolos explicam como software livremente disponível pode ser usado para avaliar subjetivamente a morfologia de sinapses, músculos e mitocôndrias em um nematode, C.elegans. Muitos estudos anteriores se basearam em métodos qualitativos para comparar alterações morfológicas.No entanto, estes podem ser problemáticos, pois podem não capturar diferenças fenotípicas sutis, podem superar e subestimar mudanças, e são avaliados subjetivamente. Nossos métodos quantitativos fornecem meios mais robustos e menos tendenciosos para avaliar mudanças morfológicas. Esses métodos poderiam ser facilmente utilizados para estudar alterações morfológicas em outras estruturas celulares ou organismos modelo, a fim de definir a função genética e as consequências das mutações associadas à doença.Comece preparando slides para imagens. Coloque uma gota de uma ágarose derretida em um slide de microscópio e pressione imediatamente para baixo a gota com outro slide de microscópio, achatando suavemente a agarose. Deixe a agarose secar por um minuto e, em seguida, separe cuidadosamente os dois slides e deixe a almofada solidificada em um dos slides.Coloque o slide no estágio do microscópio e adicione uma gota de 5 a 10 mililitros de anestésico ao centro da almofada de agarose. Use uma picareta esterilizada a calor para transferir rapidamente 10 a 15 animais da placa de estoque para a gota anestésico antes que a solução seque. Em seguida, aplique uma mancha de cobertura posicionando-a logo acima da almofada de agarose e gentilmente deixando-a cair.Imagem as regiões sinápticas com um microscópio confocal de varredura de linha acoplado a um laser de diodo semicondutor de 488 e 552 nanômetros com bombeamento óptico e equipado com software de captura de imagem. Depois de localizar os worms, mude para uma ampliação de 40X e aplique meio de imersão. Visualize a região sináptica excitando os fluoroforos com um laser de 552 nanômetros, 1%de potência para o fluorophore tagRFP, e 488 nanômetros, 2% de potência para o fluoróforo GFP.Capture imagens usando um fotodetetor híbrido e defina os ganhos para evitar a superexposição dos fluoroforos. Colete imagens de pilha Z para cobrir toda a sinapse usando o tamanho ideal da etapa Z, dependendo do objetivo. Para analisar a região sináptica comece carregando as imagens no software CellProfiler 3.1.5.Configure o módulo NameAndType e determine a região sináptica por definição manual usando o tagRFP difuso expresso do transgene UIS-115. Meça o tamanho e a fluorescência da sinapse definida à mão adicionando os módulos MeasureObjectSizeShape e MeasureObjectIntensity ao pipeline. Em seguida, calcule a intensidade relativa da fluorescência integrada adicionando o módulo CalculandoMath e dividindo as unidades de intensidade integrada obtidas a partir de JSIS37 por aquelas obtidas do UIS-115.Quando terminar a exportação de todas as medidas e cálculos. Para medir a área da célula muscular abra a imagem no software fiji e use a seleção de polígonos para rastrear cuidadosamente em torno de uma única célula muscular oblíqua. Ajuste a linha do polígono no final arrastando o ponto de âncora para melhorar o rastreamento.Navegue até a guia Analisar na parte superior do software e clique em Medir para calcular a área selecionada. Para células musculares com região degenerada ou ausente, rastreie a área ausente com a ferramenta de seleção do polígono e clique em Medir novamente. Se houver múltiplas lacunas, rastreie cada uma separadamente.Calcule a razão da área de lacuna para a área de toda a célula. Uma alta proporção indica maior extensão da degeneração muscular. E se não houver regiões ausentes, a razão é calculada como zero.Abra o Elastic e escolha classificação de pixels em criar novo projeto. Em seguida, renomeie e salve o projeto. Navegue até a guia de dados de entrada e clique em Adicionar novo e, em seguida, Adicione imagens separadas.Direcione a janela pop-up para a pasta com os arquivos TIF e selecione a imagem desejada. Na guia Seleção de recursos clique em Selecionar Recursos para selecionar todos os recursos de pixel indicados pelas caixas verdes marcadas. A seleção de pixels nesta etapa é usada para distinguir as diferentes classes de pixels na próxima etapa.Use um painel de treinamento para distinguir entre os filamentos de minosina expressos por GFP individuais e o fundo indesejado. Clique em Adicionar rótulo e rabisque fundos e espaços indesejados entre os filamentos para iniciar o treinamento de classificadores. Adicione um segundo rótulo, renomeie-o para Filamento, e rabisque sobre uma série de filamentos.Clique em Live Update para ter certeza de que a classificação foi feita corretamente. Se necessário, adicione mais rabiscos para afinar o treinamento. Uma vez realizado o classificador de treinamento, vá para o painel De exportação de previsão e clique em Escolher Configurações de imagem de exportação com probabilidades como a fonte.Certifique-se de que as sub-regiões de recorte x e y estão marcadas, e c está sem marcação. Selecione zero e um como valores de inicial e parada para c e converta o tipo de dados para 8 bits não assinados. Marque Renormalizar e, em seguida, altere o vídeo do arquivo de saída para png, renomeando o arquivo e o diretório conforme desejado.Feche a janela de configurações de exportação e exporte a imagem que acaba de ser segmentada. Em seguida, abra o arquivo png no software Fiji. Ajuste o limiar da imagem usando configurações padrão e aplique o plug-in de esqueletização, que criará uma tabela separada de resultados.Este protocolo tem sido usado para explorar a função de acetiltransferase alfa-tubulin MEC-17 no desenvolvimento da sinapse. A análise quantitativa das imagens das sinapses posterior/lateral de microtúbulos ou PLM indica que a superexpressão do MEC-17 interrompe a função normal do neurônio. Em comparação com os animais de controle do tipo selvagem que expressam o MEC-17 reduziram significativamente as regiões pré-sinápticas e a integridade sináptica.Essas técnicas também têm sido usadas para analisar modelos C.elegans de Charcot-Marie-Tooth tipo 2 ou CMT2 carregando mutações em genes associados ao CMT2. A avaliação visual da morfologia muscular da parede corporal revelou um aumento de 2,5 a 3,5 vezes nos defeitos nos animais de teste em comparação com o controle do tipo selvagem. Animais com mutações no fzo-1 e unc-116 experimentaram perda de estrias musculares, acúmulo de detritos celulares e degeneração de fibras musculares.Enquanto animais com mutações no dyn-1 experimentaram significativamente menos defeitos na morfologia muscular. Os mutantes fzo-1 e unc-116 apresentaram um aumento de cinco a seis vezes na proporção de gap para área celular única total e um comprimento médio de fibra dramaticamente menor em comparação com animais do tipo selvagem. Para que sejam feitas comparações entre as amostras é importante determinar as condições mais ideais para a aquisição de imagens e garantir que essas condições sejam usadas de forma consistente.Essas técnicas permitirão aos pesquisadores comparar alterações morfológicas em diferentes origens genéticas com abordagens quantitativas. Isso reduz a subjetividade e, portanto, ajuda a melhorar a representatividade dos dados gerados.

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Biology

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

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Biologia

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

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In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

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