For første gang har vi etableret en ændring af gener kodet for ionotropic GABAA og metabotropisk glutamat receptorer i delmængder af neuroner i den voksne honningbi hjerne. CRISPR-Cas9 genredigering kan bruges til at ændre et eller flere gener i voksne bihjerner for at udforske deres roller i læring og hukommelse under kontrollerede laboratorieforhold. Denne metode kan anvendes til at undersøge funktionen af specifikke proteiner i voksne bier, samt til at teste antistoffers specificitet mod deres tilsvarende proteiner.
Demonstration af proceduren med Irina Sinakevitch vil være Lev Kurtzman og Hyun Choi, tidligere bachelorer fra mit laboratorium. For at teste udtrykket af RDL og mGlutR1 ved immunokokemisk analyse efter CRISPR-Cas9 injektion, først bruge en online CRISPR-Cas9 værktøj til at designe vejledninger ved hjælp af guide DNA sekvens af apis mellifera, RDL, og mGlutR1. For at forberede guide RNA komplekse formationer for hver guide RNA, mærke et reagensglas for hver guide med navnet på guide RNA, og tilsæt 92 mikroliter af nukleotid-fri buffer, fire mikroliter af 100 mikromolar fluorophore, mærket transaktivering CRISPR RNA, og fire mikroliter af den relevante guide RNA-løsning til hvert rør.
Når alle materialerne er tilsat, blandes opløsningerne forsigtigt, og rørindholdet drejes i en centrifuge i en bænktopcentrifuge i fem sekunder for at sedimentere opløsningen. Hold derefter løsningerne på 95 grader Celsius i fem minutter for at oprette et guide RNA-kompleks efterfulgt af 10 minutters nedkøling ved stuetemperatur. For at forberede ribonucleoprotein komplekse formationer tilføje seks mikroliter af hver guide RNA-opløsning og seks mikroliter af 0,5 mikrogram pr microliter SP-Cas9 nuklease V3 til passende mærket rør.
Efter blid blanding inkuberes opløsningerne ved 37 grader Celsius i 10 minutter For at lave RNP ribonucleoproteinblandinger til injektion tilsættes der ved afslutningen af inkubationen fire mikroliter af hvert ribonucleoprotein til den relevante RDL. For at lave en kontrol blandes ingen-guide RNA-opløsning fire mikroliter af sporstof RNA med 92 mikroliter buffer og fire mikroliter vand. Efter tilsætning af vand, holde opløsningen i fem minutter ved 95 grader Celsius og lad blandingen til at køle ned, indtil den når stuetemperatur.
Derefter blandes seks mikroliter af no-guide RNA-opløsningen med seks mikroliter på 0,5 mikrogram pr. mikroliter Cas9 nuklease V3. Til ribonucleoproteinblandingsinjektion immobiliseres bierne i højst tre minutter på is, efter at de enkelte bier er blevet fanget i hætteglas med et lille hul i hætterne, og bierne fastgøres i mere end tre minutter på is og fastgøres hver bi i tidligere forberedte metalholdere med gaffatape. Med ryg brystkassen, vinger og hoved udsat. Brug en fem milliliter sprøjte til at fodre bierne med en en molar saccharose opløsning, indtil de ikke længere er sultne, og læg de sikrede bier i en kasse med en våd køkkenrulle for fugt.
Dernæst placere voks på indersiden af lågene i to 35 milliliter petriskåle og placere bunden af retterne på voks. Injicer den ene kindtandssucrose mellem dækslet og bunden af hver skål, og placer en fodring petriskål i hvid boks med det ene glas dias og placere den anden i sort boks med et glas dias. Placer derefter en lille kam i hver kasse og læg et mikroinjektionssystem med RDL CRISPR-Cas9 blandingen.
Ved indsprøjtning af RDL CRISPR-Cas9 injiceres median ocelli på otte bier med 345 nanoliter ribonucleoprotein RDL-blanding efterfulgt af fodring med en molarsucrose, før bierne frigives i den sorte forsøgsboks. Før et andet sæt af otte bier som kontrol uden injektioner og slip dem ind i den hvide kontrolboks. Derefter placere begge kasser i en polystyren beholder med vådt papir, observere bierne to gange om dagen for at sikre, at de har nok mad og en god luftfugtighed.
48 timer efter injektionen immobiliseres bierne på is i 30 sekunder, og der anvendes en saks til at halshugge hvert insekt. Placer hovederne i 4% paraformaldehyd i PBS under et dissekerende mikroskop i en røghætte, og brug barraquer iris saks til omhyggeligt, men hurtigt at fjerne antenner, sammensatte øjne, og den øverste exoskelet. Lad hovederne sidde i den fiksative opløsning i 10 minutter, før resten af exo skelet fra hovedet og alle de resterende luftrør.
Derefter placeres hver hjerne i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, der indeholder mindst en milliliter 4% paraformaldehyd natten over ved fire til otte grader Celsius. Næste morgen tilsættes 3,8 gram argrose til 50 milliliter destilleret vand i en erlenmeyerkolbe og mikrobølgeovn opløsningen, indtil argrose liquifies. Overfør tre til fire faste honningbi hjerner i en ny 35 millimeter petriskål og bruge silkepapir til at fjerne den overskydende fiksativ.
Hæld forsigtigt væsken argrose over hjernen og orientere prøverne i argrose, således at antennerne lapper vender opad. Efter argrose har størknet, bruge en skalpel til at skære ud enkelte blokke af argrose indeholder en enkelt hjerne og fylde hver brønd af en 24-brønd plade fyldt med en kurv med en hydrofob mesh bund og 600 mikroliter af PBS per brønd. Derefter bruge en vibratome til en erhverve 70 mikrometer tværsnit af hjernevæv fra hver argrose blok.
Placering af sektioner fra en enkelt hjerne på masken af samme kurv, som de er erhvervet. Efter mærkning af sektioner med fluorophore konjugeret antistoffer, i henhold til standard protokoller, integrere hvert dias med sektioner fra en enkelt hjerne ved hjælp af en dråbe montering medium og visualisere prøverne ved fluorescens mikroskopi. Anti-RDL etiketter neuropile i frontal del af vilde-type, men ikke CRISPR-Cas9 RDL knockout bi hjerner.
Der blev observeret en lignende specificitet for anti-mGlutR1-antistoffer. I disse repræsentative, kvantitative PCR drop off test i bier hjerner injiceres med RDL CRIPSR-Cas9, den relative reduktion af fluorestighed svarede til antallet af den modificerede guide DNA i prøven. Efter injektionen med mGlutR1 CRISPR-Cas9 var den relative ændring af guide-DNA ca. 59 % i hjernen hos injicerede bier sammenlignet med det styre-DNA, der blev observeret i hjernen hos ikke-injicerede bier.
I denne kvantitative RT-PCR ien separat gruppe af bier var den relative reduktion af messenger RNA RDL ca. 59% sammenlignet med niveauet af RNA i ikke-injicerede bier, og den relative reduktion af messenger mGlutR1 RNA i injicerede bier var ca. 53%Især, injektionen af RDL CRISPR-Cas9 gennem ocelli muligvis ikke altid nå et stort antal hjerneceller. For eksempel, i disse præparater kun én være ud af otte havde RDL CRISPR-Cas9 i et stort antal hjerneceller i forhold til andre bi hjerner. Med RDL CRISPR-Cas9 koncentreret i cellerne i protocerebrum, men ikke antennelappen.
Sørg for at undgå frossen og refrosen RNA. Pas på ikke at overkøle bierne. Udnyt dem straks, når stoppet bevæger sig i hætteglasset.
Denne teknik kan bruges til at undersøge virkningerne af reduktionen af hæmmende ionotropic og metabotropiske receptorer i champignon kroppen og centrale kompleks på honning bi adfærd.