7.7K Views
•
09:25 min
•
January 30th, 2020
DOI :
January 30th, 2020
•0:05
Introduction
1:02
Resistance to Dieldrin (RDL) and Metabotropic Glutamate Receptor 1 (mGlutR1) Protein Expression
3:15
Injection Procedure
5:03
Brain Tissue Harvest and Sectioning
7:11
Results: Representative Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptor Antibody Testing in Honeybee Brain Sections
8:44
Conclusion
Transcript
Voor het eerst hebben we een wijziging vastgesteld van de genen gecodeerd voor ionotropische GABAA en metabotropische glutamaatreceptoren in subsets van neuronen in de volwassen honingbijenhersenen. CRISPR-Cas9 genbewerking kan worden gebruikt om een of meerdere genen in volwassen bijenhersenen te wijzigen om hun rol in leren en geheugen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden te verkennen. Deze methode kan worden gebruikt om de functie van specifieke eiwitten bij volwassen bijen te bestuderen en om de specificiteit van antilichamen te testen tegen de bijbehorende eiwitten.
Het aantonen van de procedure met Irina Sinakevitch zal Lev Kurtzman en Hyun Choi, voormalige studenten van mijn laboratorium. Om de expressie van RDL en mGlutR1 te testen door immunocytochemische analyse na CRISPR-Cas9-injectie, gebruikt u eerst een online CRISPR-Cas9-tool om de geleidegeleiders te ontwerpen met behulp van de geleide-DNA-sequentie van apis mellifera, RDL en mGlutR1. Om gids RNA complexe formaties voor te bereiden voor elke gids RNA, label een reageerbuis voor elke gids met de naam van de gids RNA, en voeg 92 microliters van nucleotide-vrije buffer, vier microliters van 100 micromolar fluorofoforeren, gelabeld transactiverende CRISPRRNA, en vier microliters van de juiste gids RNA oplossing aan elke buis.
Wanneer alle materialen zijn toegevoegd, meng de oplossingen voorzichtig en draai de buisinhoud vijf seconden in een bench-top centrifuge om de oplossing te bespeuren. Houd vervolgens vijf minuten lang de oplossingen op 95 graden Celsius om een gidsRNA-complex te maken, gevolgd door 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur. Ter voorbereiding van de ribonucleoprotein complexe formaties voeg zes microliters van elke gids RNA-oplossing en zes microliters van 0,5 microgram per microliter SP-Cas9 nuclease V3 aan de juiste gelabelde buizen.
Na het zachte mengen, incubeer de oplossingen op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten Om RNP ribonucleoprotein mengsels voor injectie te maken, voeg aan het einde van de incubatie vier microliters van elke ribonucleoprotein toe aan de juiste RDL. Om een controle te maken, no-guide RNA oplossing mix vier microliters van tracer RNA met 92 microliter buffer en vier microliters van water. Na toevoeging van water, houd de oplossing gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius en laat het mengsel afkoelen totdat het kamertemperatuur bereikt.
Meng vervolgens zes microliters van de no-guide RNA-oplossing met zes microliters van 0,5 microgram per microliter Cas9 nuclease V3. Voor ribonucleoprotein mengsel injectie, na het vastleggen van individuele bijen in flesjes met een klein gaatje in de doppen, immobiliseren de bijen voor niet meer dan drie minuten op ijs en zet elke bij in eerder voorbereide metalen houders met duct tape. Met de rug thorax, vleugels en hoofd blootgesteld. Gebruik een spuit van vijf milliliter om de bijen te voeden met een een molaire sacharoseoplossing totdat ze geen honger meer hebben, en plaats de beveiligde bijen in een doos met een natte papieren handdoek voor vochtigheid.
Plaats vervolgens wax op de binnenkant van de deksels van twee petrischaaltjes van 35 milliliter en leg de bodems van de gerechten op de was. Injecteer een molaire sacharose tussen de cover en onderkant van elk gerecht, en plaats een voeden petrischaal in witte doos met een glazen glijbaan en plaats de andere in zwarte doos met een glazen glijbaan. Plaats vervolgens een kleine kam in elke doos en laad een microinjectiesysteem met het RDL CRISPR-Cas9 mengsel.
Voor RDL CRISPR-Cas9 injectie, injecteer de mediane ocelli van acht bijen met 345 nanoliters van ribonucleoprotein RDL mix gevolgd door voeding met een molaire sacharose voordat het vrijgeven van de bijen in de zwarte experimentele doos. Voer een tweede set van acht bijen als controles zonder injecties en laat ze los in de witte controlekast. Plaats vervolgens beide dozen in een polystyreencontainer met nat papier, waarbij de bijen twee keer per dag worden waargenomen om ervoor te zorgen dat ze voldoende voedsel en een goede luchtvochtigheid hebben.
48 uur na de injectie, immobiliseer de bijen op ijs gedurende 30 seconden en gebruik een schaar om elk insect te onthoofden. Plaats de koppen in 4%paraformaldehyde IN PBS onder een ontledende microscoop in een rookkap en gebruik een staafschaar van barraquer om de antennes, samengestelde ogen en het bovenste exoskelet voorzichtig maar snel te verwijderen. Laat de hoofden 10 minuten in de fixatieve oplossing zitten voordat u de rest van het exoskelet uit het hoofd en alle resterende luchtpijp verwijdert.
Plaats vervolgens elke hersenen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met ten minste één milliliter van 4% paraformaldehyde 's nachts bij vier tot acht graden Celsius. De volgende ochtend, voeg 3,8 gram argrose tot 50 milliliter gedestilleerd water in een erlenmeyer fles en magnetron de oplossing tot dergrose liquifies. Breng drie tot vier vaste honingbijenhersenen in een nieuwe 35 millimeter petrischaal en gebruik tissuepapier om het overtollige fixatiemiddel te verwijderen.
Giet de vloeistof die zich over de hersenen overdurmt en oriënteer de monsters in dergrose, zodat de antennelobben naar boven gericht zijn. Nadat dergrose is gestold, gebruik dan een scalpel uit te snijden individuele blokken van argrose met een enkele hersenen en vul elke put van een 24-goed plaat geladen met een mand met een hydrofobe mesh bodem en 600 microliters van PBS per goed. Gebruik vervolgens een vibratome om een verwerven 70 micrometer dwarsdoorsnedes van het hersenweefsel van elkrgrose blok.
Het plaatsen van de secties van een enkele hersenen op het gaas van dezelfde mand als ze worden verworven. Na het labelen van de secties met fluorofofoër geconjugeerde antilichamen, volgens standaardprotocollen, insluiten elke dia met secties van een enkele hersenen met behulp van een druppel montagemedium en visualiseren de monsters door fluorescentie microscopie. Anti-RDL labels neuropils in de frontale sectie van wild-type, maar niet CRISPR-Cas9 RDL knock-out bijenhersenen.
Een soortgelijke specificiteit werd waargenomen voor anti-mGlutR1 antilichamen. In deze representatieve, kwantitatieve PCR drop-off tests in bijen hersenen geïnjecteerd met RDL CRIPSR-Cas9, de relatieve vermindering van de fluoresence kwam overeen met het aantal van de gewijzigde gids DNA in het monster. Na mGlutR1 CRISPR-Cas9 injectie, de relatieve wijziging van de gids DNA was ongeveer 59% in de hersenen van geïnjecteerde bijen in vergelijking met de gids DNA waargenomen in de hersenen van niet-geïnjecteerde bijen.
In deze kwantitatieve RT-PCR ina aparte groep bijen was de relatieve vermindering van de boodschapper RNA RDL ongeveer 59% in vergelijking met het niveau van RNA in niet-geïnjecteerde bijen, en de relatieve vermindering van de boodschapper mGlutR1 RNA in geïnjecteerde bijen was ongeveer 53%Met name de injectie van RDL CRISPR-Cas9 door de ocelli zou niet altijd een groot aantal hersencellen kunnen bereiken. Bijvoorbeeld, in deze preparaten slechts een van de acht had RDL CRISPR-Cas9 in grote aantallen hersencellen in vergelijking met andere bijenhersenen. Met de RDL CRISPR-Cas9 geconcentreerd in de cellen van het protocerebrum, maar niet de antennekwab.
Zorg ervoor dat bevroren en opnieuw bevroren RNA wordt vermeden. Zorg ervoor dat je de bijen niet overkoelt. Gebruik ze onmiddellijk zodra de stop in de flacon beweegt.
Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van de vermindering van remmende ionotropische en metabotropische receptoren in het paddenstoellichaam te bestuderen en centraal complex op honingbijgedrag.
Hier gepresenteerd is een protocol om de CRISPR-Cas9 systeem te gebruiken voor het verminderen van de productie van een eiwit in de volwassen honingbij hersenen om antilichaam specificiteit te testen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved