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January 30th, 2020
DOI :
January 30th, 2020
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Introduction
1:02
Resistance to Dieldrin (RDL) and Metabotropic Glutamate Receptor 1 (mGlutR1) Protein Expression
3:15
Injection Procedure
5:03
Brain Tissue Harvest and Sectioning
7:11
Results: Representative Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptor Antibody Testing in Honeybee Brain Sections
8:44
Conclusion
Transcript
पहली बार हमने वयस्क शहद मधुमक्खी मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के सबसेट में आयनोट्रोपिक गैबएए और मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए कोडित जीन का एक संशोधन स्थापित किया है। CRISPR-Cas9 जीन संपादन नियंत्रित प्रयोगशाला की स्थिति के तहत सीखने और स्मृति में अपनी भूमिकाओं का पता लगाने के लिए वयस्क मधुमक्खी दिमाग में एक या कई जीन को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि का उपयोग वयस्क मधुमक्खियों में विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के साथ-साथ उनके संबंधित प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
इरीना सिनाकेविच के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन लेव कुर्ट्जमैन और ह्यून चोई, मेरी प्रयोगशाला से पूर्व स्नातक होंगे। CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के बाद इम्यूनोसाइटोकेमिकल विश्लेषण द्वारा आरडीएल और mGlutR1 की अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए, सबसे पहले, एपिस मेलिफेरा, आरआरएल और mGlutR1 के गाइड डीएनए अनुक्रम का उपयोग करके गाइड डिजाइन करने के लिए एक ऑनलाइन CRISPR-Cas9 उपकरण का उपयोग करें। प्रत्येक गाइड आरएनए के लिए गाइड आरएनए जटिल संरचनाओं को तैयार करने के लिए, गाइड आरएनए के नाम के साथ प्रत्येक गाइड के लिए एक टेस्ट ट्यूब लेबल, और न्यूक्लियोटाइड मुक्त बफर के 92 माइक्रोलीटर, 100 माइक्रोमोलर फ्लोरोफोर के चार माइक्रोलीटर, लेबल पर निष्क्रिय CRISPR आरएनए, और प्रत्येक ट्यूब के लिए उपयुक्त गाइड आरएनए समाधान के चार माइक्रोलीटर जोड़ें।
जब सभी सामग्रियों को जोड़ा गया हो, तो समाधानों को धीरे-धीरे मिलाएं और समाधान को तलछट करने के लिए पांच सेकंड के लिए बेंच-टॉप अपकेंद्रित्र में ट्यूब सामग्री को स्पिन करें। फिर, एक गाइड आरएनए परिसर बनाने के लिए पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक समाधान रखें और इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट कूल-डाउन करें। राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन जटिल संरचनाओं को तैयार करने के लिए प्रत्येक गाइड आरएनए समाधान के छह माइक्रोलीटर और 0.5 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर एसपी-Cas9 नाभिक V3 को उचित लेबल वाली ट्यूबों में जोड़ें।
कोमल मिश्रण के बाद, इंजेक्शन के लिए आरएनपी राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन मिश्रण बनाने के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें, इनक्यूबेशन के अंत में उपयुक्त आरडीएल में प्रत्येक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन के चार माइक्रोलीटर जोड़ें। कंट्रोल करने के लिए नो-गाइड आरएनए सॉल्यूशन में ट्रेसर आरएनए के चार माइक्रोलीटर को बफर के 92 माइक्रोलीटर और पानी के चार माइक्रोलीटर मिलाते हैं। पानी के अलावा के बाद, समाधान को 95 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए रखें और मिश्रण को ठंडा होने दें जब तक कि यह कमरे के तापमान तक न पहुंच जाए।
फिर, नो-गाइड आरएनए समाधान के छह माइक्रोलीटर को 0.5 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर के छह माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं Cas9 नाभिक V3। रिबो न्यूक्लियोप्रोटीन मिश्रण इंजेक्शन के लिए, टोपियां में एक छोटे से छेद के साथ शीशियों में व्यक्तिगत मधुमक्खियों पर कब्जा करने के बाद, बर्फ पर तीन मिनट से अधिक नहीं के लिए मधुमक्खियों को स्थिर करें और डक्ट टेप के साथ पहले से तैयार धातु धारकों में प्रत्येक मधुमक्खी को सुरक्षित करें। पीछे छाती, पंख और सिर के साथ उजागर। मधुमक्खियों को एक मोलर सुक्रोज समाधान के साथ खिलाने के लिए पांच मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें जब तक कि वे अब भूखे न हों, और सुरक्षित मधुमक्खियों को आर्द्रता के लिए गीले कागज के तौलिया के साथ एक बॉक्स में रखें।
इसके बाद, दो 35 मिलीलीटर पेट्री व्यंजनों के ढक्कन के अंदर मोम रखें और मोम पर व्यंजनों के नीचे रखें। प्रत्येक डिश के कवर और नीचे के बीच एक मोलर सुक्रोज इंजेक्ट करें, और एक ग्लास स्लाइड के साथ सफेद बॉक्स में एक फीडिंग पेट्री डिश रखें और दूसरे को एक ग्लास स्लाइड के साथ ब्लैक बॉक्स में रखें। फिर, प्रत्येक बॉक्स में एक छोटा कंघी रखें और आरडीएल CRISPR-Cas9 मिश्रण के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम लोड करें।
आरडीएल CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के लिए, राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन आरडीएल मिश्रण के ३४५ नैनोलीटर के साथ आठ मधुमक्खियों के औसत ओस्ली इंजेक्ट और उसके बाद काले प्रयोगात्मक बॉक्स में मधुमक्खियों को रिहा करने से पहले एक मोलर सुक्रोज के साथ खिलाने के बाद । किसी भी इंजेक्शन के बिना नियंत्रण के रूप में आठ मधुमक्खियों का एक दूसरा सेट खिलाएं और उन्हें सफेद नियंत्रण बॉक्स में छोड़ दें। फिर, दोनों बक्से को गीले कागज के साथ एक पॉलीस्टीरिन कंटेनर में रखें, मधुमक्खियों को दिन में दो बार देखते हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि उनके पास पर्याप्त भोजन और अच्छी आर्द्रता है।
इंजेक्शन के 48 घंटे बाद, मधुमक्खियों को 30 सेकंड के लिए बर्फ पर स्थिर करें और प्रत्येक कीट को काटना के लिए कैंची का उपयोग करें। एक धुएं के हुड में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में सिर रखें, और ध्यान से लेकिन तेजी से एंटीना, यौगिक आंखें, और शीर्ष एक्सोस्केलेटन को हटाने के लिए बाराक्वेर आईरिस कैंची का उपयोग करें। सिर से एक्सो कंकाल के बाकी और शेष श्वासनली के सभी को हटाने से पहले 10 मिनट के लिए सुधारात्मक समाधान में बैठने के लिए सिर की अनुमति दें।
फिर, प्रत्येक मस्तिष्क को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के कम से कम एक मिलीलीटर चार से आठ डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें। अगली सुबह, एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में आसुत पानी के 50 मिलीलीटर में 3.8 ग्राम argrose जोड़ें और जब तक कि आरर्ग्रोज लिक्विफीज न हो जाए तब तक समाधान माइक्रोवेव करें। तीन से चार फिक्स्ड शहद मधुमक्खी दिमाग को एक नए 35 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और अतिरिक्त सुधारक को हटाने के लिए टिश्यू पेपर का उपयोग करें।
ध्यान से दिमाग पर तरल argrose डालना और argrose के भीतर नमूनों उन्मुख इतना है कि एंटीना पालि ऊपर का सामना कर रहे हैं । अरगरोज के जम जाने के बाद, एक स्केलपेल का उपयोग एक मस्तिष्क युक्त अरगरोज के व्यक्तिगत ब्लॉकों को काटने के लिए करें और एक हाइड्रोफोबिक जाल बॉटम और पीबीएस के 600 माइक्रोलीटर के साथ एक टोकरी से भरी हुई 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें। फिर, प्रत्येक एर्गरोज ब्लॉक से मस्तिष्क के ऊतकों के 70 माइक्रोमीटर क्रॉस सेक्शन प्राप्त करने के लिए एक वाइब्रेकोम का उपयोग करें।
एक ही मस्तिष्क से वर्गों को एक ही टोकरी के जाल पर रखना क्योंकि वे अधिग्रहीत किए जाते हैं। फ्लोरोफोर संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ वर्गों लेबलिंग के बाद, मानक प्रोटोकॉल के अनुसार, बढ़ते माध्यम की एक बूंद का उपयोग कर एक ही मस्तिष्क से वर्गों के साथ प्रत्येक स्लाइड एम्बेड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूनों की कल्पना । एंटी-आरडीएल लेबल वाइल्ड-टाइप के फ्रंटल सेक्शन में न्यूरोपिल्स, लेकिन CRISPR-Cas9 RDL नॉकआउट मधुमक्खी दिमाग नहीं।
एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी के लिए एक समान विशिष्टता देखी गई थी। इन प्रतिनिधि में, आरडीएल CRIPSR-Cas9 के साथ इंजेक्शन मधुमक्खियों के दिमाग में मात्रात्मक पीसीआर ड्रॉप ऑफ परीक्षण, फ्लोरोसेंस की सापेक्ष कमी नमूने में संशोधित गाइड डीएनए की संख्या के अनुरूप थी। mGlutR1 CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के बाद, गाइड डीएनए के सापेक्ष संशोधन गैर इंजेक्शन मधुमक्खियों के दिमाग में मनाया गाइड डीएनए की तुलना में इंजेक्शन मधुमक्खियों के दिमाग में लगभग ५९% था ।
मधुमक्खियों के इस मात्रात्मक आरटी-पीसीआर आईएनए अलग समूह में मैसेंजर आरएनए आरडीएल की सापेक्ष कमी गैर-इंजेक्शन मधुमक्खियों में आरएनए के स्तर की तुलना में लगभग 59% थी, और इंजेक्शन मधुमक्खियों में मैसेंजर mGlutR1 आरएनए की सापेक्ष कमी लगभग 53% विशेष रूप से थी, ओसेली के माध्यम से आरडी CRISPLR-Cas9 का इंजेक्शन हमेशा मस्तिष्क कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या तक नहीं पहुंच सकता है। उदाहरण के लिए, इन तैयारियों में केवल एक आठ में से एक ही था RDL CRISPR-Cas9 मस्तिष्क कोशिकाओं की बड़ी संख्या में अंय मधुमक्खी दिमाग की तुलना में । आरडीएल CRISPR-Cas9 के साथ प्रोटोसेरेब्रम की कोशिकाओं के भीतर केंद्रित है, लेकिन एंटीनाल पालि नहीं।
जमे हुए और फिर से जमे हुए आरएनए से बचने के लिए सुनिश्चित करें। मधुमक्खियों को ओवरकूल न करने का ध्यान रखें। उन्हें तुरंत दोहन एक बार शीशी में चलती बंद करो।
इस तकनीक का उपयोग मशरूम शरीर और शहद मधुमक्खी व्यवहार पर केंद्रीय परिसर में निरोधात्मक आयनोपिक और मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर्स की कमी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत एंटीबॉडी विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए वयस्क मधुमक् खी मस्तिष्क में प्रोटीन के उत्पादन को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
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