처음으로 우리는 성인 꿀벌 두뇌에 있는 뉴런의 하위 집합에 있는 ionotropic GABAA 및 대사위편 글루타민산체 수용체를 위해 코딩된 유전자의 수정을 설치했습니다. CRISPR-Cas9 유전자 편집은 통제된 실험실 조건하에서 학습및 기억에 있는 그들의 역할을 탐구하기 위하여 성인 꿀벌 두뇌에 있는 하나 또는 다중 유전자를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 성인 꿀벌에서 특정 단백질의 기능을 연구하고 해당 단백질에 대한 항체의 특이성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
이리나 시나케비치와 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 온 레프 커츠만과 최현이 될 것이다. CRISPR-Cas9 주입 후 면역 세포화학 적 분석에 의한 RDL 및 mGlutR1의 발현을 테스트하려면 먼저 온라인 CRISPR-Cas9 도구를 사용하여 가이드 DNA 서열을 사용하여 가이드를 설계합니다. 각 가이드 RNA에 대한 RNA 복합 형성안내를 준비하고, 각 가이드 RNA의 이름으로 각 가이드에 대해 하나의 시험관을 라벨을 붙이고, 뉴클레오티드 프리 버퍼 92마이크로리터, 100개의 마이크로몰라 플루오로포어4개소리터, CRISPR RNA 를 표지된 4개의 마이크로리터, 각 튜브에 적합한 가이드 RNA 용액의 4마이크로리터를 추가한다.
모든 재료가 추가되면 솔루션을 부드럽게 혼합하고 튜브 내용을 벤치 상단 원심분리기에서 5초 간 회전하여 용액을 퇴적시합니다. 그런 다음, 가이드 RNA 복합체를 만들고 실온에서 10 분 냉각을 만들기 위해 5 분 동안 섭씨 95도까지 용액을 유지하십시오. 리보뉴클레오단백질 복합체 형성을 준비하기 위해 각 가이드 RNA 용액의 6마이크로리터와 마이크로리터 SP-Cas9 뉴클레아아제 V3당 0.5 마이크로리터를 적절히 표지된 튜브에 첨가한다.
부드러운 혼합 후, 10 분 동안 37섭씨37도에서 용액을 배양하여 주입을 위한 RNP 리보뉴클레오단백질 혼합물을 만들고, 배양의 끝에 각 리보뉴클레오단백질의 4개의 마이크로리터를 적절한 RDL에 첨가한다. 제어를 만들기 위해, 노 가이드 RNA 용액은 92 마이크로 리터의 완충제와 4 개의 마이크로 리터의 물과 트레이서 RNA의 4 마이크로 리터를 혼합합니다. 물을 첨가한 후, 용액을 섭씨 95도에서 5분간 유지하고 실온에 도달할 때까지 혼합물을 식히도록 합니다.
그런 다음, 마이크로리터 Cas9 nuclease V3당 0.5 마이크로그램의 6개의 마이크로리터와 노가이드 RNA 용액의 6개의 마이크로리터를 혼합한다. 리보뉴클레오단백질 혼합물 주입의 경우, 캡에 작은 구멍이 있는 바이알에서 개별 꿀벌을 포획한 후, 얼음에 3분 이상 꿀벌을 고정시키고 각 꿀벌을 덕트 테이프로 이전에 준비된 금속 홀더에 고정시킵니다. 뒤쪽 흉부, 날개와 머리가 노출되어 있습니다. 5 밀리리터 주사기를 사용하여 더 이상 배가 고프지 않을 때까지 한 마리의 어금니 자당 용액으로 꿀벌을 먹이고, 습기를 위해 젖은 종이 타월이있는 상자에 고정 된 꿀벌을 놓습니다.
다음으로, 35밀리리터 페트리 접시 두 개가 있는 뚜껑 안쪽에 왁스를 놓고 접시의 바닥을 왁스 위에 놓습니다. 각 접시의 커버와 바닥 사이에 어금니 자당 한 개를 주입하고, 한 잔의 유리 슬라이드와 흰색 상자에 먹이 페트리 접시 를 넣고 하나의 유리 슬라이드와 블랙 박스에 배치합니다. 그런 다음, 각 상자에 작은 빗을 놓고 RDL CRISPR-Cas9 혼합물로 미세 주입 시스템을로드합니다.
RDL CRISPR-Cas9 주사의 경우, 리보뉴클레오프로틴 RDL 믹스의 345 나노리터와 함께 8마리의 꿀벌의 중앙값 오젤리를 주입한 다음, 꿀벌을 흑색 실험 상자에 방출하기 전에 하나의 어금니 자당으로 먹이를 넣습니다. 주사없이 컨트롤로 여덟 꿀벌의 두 번째 세트를 공급하고 흰색 제어 상자에 해제. 그런 다음 두 상자를 젖은 종이가 있는 폴리스티렌 용기에 넣고, 하루에 두 번 벌을 관찰하여 충분한 음식과 습도가 있는지 확인합니다.
주입 후 48시간 후, 꿀벌을 얼음위에 30초 동안 고정시키고 가위를 사용하여 각 곤충을 참수합니다. 연기 후드에 해부 현미경 아래 PBS에서 4 %의 파라 포름알데히드에 머리를 배치하고, 신중하지만 신속하게 안테나, 화합물 눈, 상단 외골격을 제거하기 위해 바라커 홍채 가위를 사용합니다. 머리와 나머지 기관에서 엑소 스켈레톤의 나머지 부분을 제거하기 전에 머리가 10 분 동안 고정 솔루션에 앉을 수 있도록하십시오.
그런 다음 각 뇌를 섭씨 4~8도에서 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드를 함유한 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브에 배치합니다. 다음 날 아침, 3.8 그램의 아르그로즈를 erlenmeyer 플라스크에 50 밀리리터의 증류수에 넣고 아르그로즈가 액화될 때까지 용액을 전자 레인지에 넣습니다. 3~4개의 고정 꿀벌 두뇌를 새로운 35mm 페트리 접시에 옮기고 티슈 페이퍼를 사용하여 과도한 고정을 제거합니다.
조심스럽게 뇌에 액체 아르그로즈를 붓고 안테나 로브가 향하고 있도록 아르그로즈 내의 샘플을 방향을 지정합니다. 아르그로가 고화된 후, 메스를 사용하여 단일 뇌를 함유한 개별 적인 아르그로즈 블록을 잘라내고 소수성 메쉬 바닥과 600 마이크로리터의 PBS가 있는 바구니 1개가 담긴 24웰 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 그런 다음, 각 아르그로즈 블록으로부터 뇌 조직의 70 마이크로미터 단면을 획득하기 위해 진동을 사용한다.
단일 뇌의 섹션을 획득하는 것과 동일한 바구니의 메시에 배치합니다. 형광소로 섹션을 부착 한 후 공수 항체, 표준 프로토콜에 따르면, 장착 매체의 방울을 사용하여 단일 뇌의 섹션으로 각 슬라이드를 포함하고 형광 현미경 검사법에 의해 샘플을 시각화. 안티 RDL 야생 유형의 정면 섹션에서 신경 필 레이블, 하지만 CRISPR-Cas9 RDL 녹아웃 꿀벌 두뇌.
항-mGlutR1 항체에 대해 유사한 특이성을 관찰했다. 이러한 대표적인, 정량적 PCR은 RDL CRIPSR-Cas9로 주입된 꿀벌 뇌의 시험을 중단하며, 형광의 상대적 감소는 샘플내의 수정된 가이드 DNA의 수에 대응하였다. mGlutR1 CRISPR-Cas9 주사 후, 가이드 DNA의 상대적 수정은 비 주입 꿀벌의 뇌에서 관찰 된 가이드 DNA에 비해 주입 된 꿀벌의 뇌에서 약 59 %였다.
이러한 정량적 RT-PCR ina 별도 군에서 메신저 RNA RDL의 상대적 감소는 비주입 꿀벌의 RNA 수준에 비해 약 59%였으며, 주입된 꿀벌에서 메신저 mGlutR1 RNA의 상대적 감소는 약 53%였으며, 특히, 오셀리를 통한 RDL CRISPR-Cas9의 주사는 항상 많은 수의 뇌 세포에 도달하지 못할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 제제에서는 8개 중 단 1개만 다른 꿀벌 뇌에 비해 많은 수의 뇌 세포에서 RDL CRISPR-Cas9를 가졌다. RDL CRISPR-Cas9는 프로토세레브럼의 세포 내에 집중되어 있지만 안테나 로브는 아닙니다.
냉동 및 재냉동 RNA를 피하십시오. 꿀벌을 과도하게 식히지 않도록 주의하십시오. 바이알에서 움직이지 않는 중지가 되면 즉시 활용하십시오.
이 기술은 버섯 본체및 꿀벌 행동에 중앙 복합체에 있는 억제 이오노로픽 및 대사위피 수용체의 감소의 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
