For første gang har vi etablert en modifikasjon av genene kodet for ionotropisk GABAA og metabotropiske glutamatreseptorer i undergrupper av nevroner i den voksne honningbiehjernen. CRISPR-Cas9 genredigering kan brukes til å modifisere ett eller flere gener i voksne biehjerner for å utforske sine roller i læring og minne under kontrollerte laboratorieforhold. Denne metoden kan brukes til å studere funksjonen til spesifikke proteiner i voksne bier, samt å teste spesifisiteten av antistoffer mot deres tilsvarende proteiner.
Demonstrere prosedyren med Irina Sinakevitch vil være Lev Kurtzman og Hyun Choi, tidligere studenter fra laboratoriet mitt. For å teste uttrykket for RDL og mGlutR1 ved immunocytokjemisk analyse etter CRISPR-Cas9 injeksjon, først, bruk et online CRISPR-Cas9 verktøy for å designe guidene ved hjelp av guiden DNA-sekvensen av apis mellifera, RDL og mGlutR1. For å forberede guide RNA komplekse formasjoner for hver guide RNA, merk ett reagensrør for hver guide med navnet på guiden RNA, og tilsett 92 mikroliter nukleotidfri buffer, fire mikroliter på 100 mikromolarfluor, merket transaktivering CRISPR RNA og fire mikroliter av riktig guide RNA-løsning til hvert rør.
Når alle materialene er tilsatt, bland løsningene forsiktig og spinn rørinnholdet i en benk-top sentrifuge i fem sekunder for å sedimentere løsningen. Deretter holder løsningene til 95 grader Celsius i fem minutter for å skape et guide RNA-kompleks etterfulgt av 10 minutters nedkjøling ved romtemperatur. For å forberede ribonucleoprotein komplekse formasjoner tilsett seks mikroliter av hver guide RNA løsning og seks mikroliter på 0,5 mikrogram per mikroliter SP-Cas9 kjerner V3 til riktig merket rør.
Etter mild blanding, inkubere løsningene ved 37 grader Celsius i 10 minutter For å lage RNP ribonucleoprotein blandinger til injeksjon, på slutten av inkubasjonen legge fire mikroliter av hver ribonucleoprotein til riktig RDL. For å gjøre en kontroll blander RNA-løsning ikke fire mikroliter av tracer RNA med 92 mikroliter buffer og fire mikroliter vann. Etter tilsetning av vann, hold løsningen i fem minutter ved 95 grader Celsius og la blandingen avkjøles til den når romtemperatur.
Bland deretter seks mikroliter av RNA-løsningen uten veiledning med seks mikroliter på 0,5 mikrogram per mikroliter Cas9-kjerne V3. For ribonucleoprotein blanding injeksjon, etter å ha fanget individuelle bier i hetteglass med et lite hull i caps, immobilisere biene i ikke mer enn tre minutter på is og fest hver bie i tidligere forberedtmetallholdere med duct tape. Med ryggen thorax, vinger og hode utsatt. Bruk en fem milliliter sprøyte til å mate biene med en molar sukroseløsning til de ikke lenger er sultne, og legg de sikrede biene i en boks med et vått papirhåndkle for fuktighet.
Deretter legger du voks på innsiden av lokkene på to 35 milliliter petriskåler og legger bunnen av oppvasken på voksen. Injiser en molarsukrose mellom dekselet og bunnen av hver tallerken, og legg en fôringsskål i hvit boks med ett glasssklie og legg den andre i svart boks med ett glasssklie. Deretter plasserer du en liten kam i hver boks og legger i et mikroinjeksjonssystem med RDL CRISPR-Cas9-blandingen.
For RDL CRISPR-Cas9 injeksjon, injiser median ocelli av åtte bier med 345 nanoliter ribonucleoprotein RDL blanding etterfulgt av fôring med en molar sukrose før du slipper biene inn i den svarte eksperimentelle boksen. Mat et annet sett med åtte bier som kontroller uten injeksjoner og slipp dem inn i den hvite kontrollboksen. Deretter plasserer du begge boksene i en polystyrenbeholder med vått papir, og observerer biene to ganger om dagen for å sikre at de har nok mat og god fuktighet.
48 timer etter injeksjonen immobiliserer biene på is i 30 sekunder og bruker saks til å halshugge hvert insekt. Plasser hodene i 4% paraformaldehyd i PBS under et dissekerende mikroskop i en røykhette, og bruk barraquer iris saks for å forsiktig, men raskt fjerne antenner, sammensatte øyne og topp eksoskjelett. La hodene sitte i den fikseringsmiddelløsningen i 10 minutter før du fjerner resten av exo-skjelettet fra hodet og alle de gjenværende luftrøret.
Deretter plasserer du hver hjerne i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder minst en milliliter 4% paraformaldehyd over natten ved fire til åtte grader Celsius. Neste morgen, tilsett 3,8 gram argrose til 50 milliliter destillert vann i en erlenmeyerkolbe og mikrobølgeovn løsningen til argroseliquifies. Overfør tre til fire faste honningbiehjerner til en ny 35 millimeter petriskål og bruk silkepapir for å fjerne overflødig fikseringsmiddel.
Hell forsiktig den flytende argrose over hjernen og orienter prøvene i argrose slik at antennene flikene vender opp. Etter at argrose har størknet, bruk en skalpell til å kutte ut individuelle blokker av argrose som inneholder en enkelt hjerne og fyll hver brønn av en 24-brønns plate lastet med en kurv med en hydrofob mesh bunn og 600 mikroliter PBS per brønn. Deretter bruker du en vibratom til å skaffe 70 mikrometer tverrsnitt av hjernevevet fra hver argroseblokk.
Plassere seksjonene fra en enkelt hjerne på nettet av samme kurv som de er kjøpt. Etter merking av seksjonene med fluoroforkonjugerte antistoffer, i henhold til standardprotokoller, bygger du inn hvert lysbilde med seksjoner fra en enkelt hjerne ved hjelp av en dråpe monteringsmedium og visualiserer prøvene ved fluorescensmikroskopi. Anti-RDL merker neuropils i den fremre delen av villtype, men ikke CRISPR-Cas9 RDL knockout bie hjerner.
En lignende spesifisitet ble observert for anti-mGlutR1 antistoffer. I disse representative, kvantitative PCR drop off tester i bier hjerner injisert med RDL CRIPSR-Cas9, den relative reduksjonen av fluoresence korresponderte med antall modifiserte guide DNA i prøven. Etter mGlutR1 CRISPR-Cas9 injeksjon, den relative modifikasjonen av guide DNA var ca 59% i hjernen til injiserte bier sammenlignet med guide DNA observert i hjernen til ikke-injisert bier.
I denne kvantitative RT-PCR inen egen gruppe bier var den relative reduksjonen av budbringeren RNA RDL ca. 59 % sammenlignet med rna-nivået hos ikke-injiserte bier, og den relative reduksjonen av budbringeren mGlutR1 RNA hos injiserte bier var ca. 53 %Spesielt injeksjonen av RDL CRISPR-Cas9 gjennom ocellien kunne ikke alltid nå et stort antall hjerneceller. For eksempel, i disse preparatene bare en av åtte hadde RDL CRISPR-Cas9 i et stort antall hjerneceller sammenlignet med andre bie hjerner. Med RDL CRISPR-Cas9 konsentrert i cellene i protocerebrum, men ikke antennel lobe.
Pass på å unngå frosne og refrozen RNA. Pass på at du ikke overkjøler biene. Sele dem umiddelbart når du slutter å bevege seg i hetteglasset.
Denne teknikken kan brukes til å studere effekten av reduksjon av hemmende ionotropiske og metabotropiske reseptorer i soppkroppen og sentralt kompleks på honningbieatferd.
