För första gången har vi etablerat en modifiering av de gener som kodas för jonomtropiska GABAA och metabotropiska glutamatreceptorer i undergrupper av nervceller i den vuxna honungsbiet hjärnan. CRISPR-Cas9 genredigering kan användas för att modifiera en eller flera gener i vuxna bihjärnor för att utforska sina roller i inlärning och minne under kontrollerade laboratorieförhållanden. Denna metod kan användas för att studera funktionen hos specifika proteiner hos vuxna bin, samt för att testa antikropparnas specificitet mot deras motsvarande proteiner.
Demonstrera förfarandet med Irina Sinakevitch kommer att Lev Kurtzman och Hyun Choi, tidigare studenter från mitt laboratorium. För att testa uttrycket av RDL och mGlutR1 genom immuncytokemisk analys efter CRISPR-Cas9 injektion, först, använd en online CRISPR-Cas9 verktyg för att utforma guiderna med hjälp av guide DNA-sekvensen av APIS mellifera, RDL, och mGlutR1. För att förbereda guide RNA-komplexformationer för varje guide-RNA, märka ett provrör för varje guide med namnet på guide-RNA, och tillsätt 92 mikroliter av nukleotidfri buffert, fyra mikroliter på 100 mikromolarfluorofor, märkt transaktiva CRISPR-RNA och fyra mikroliter av lämplig guide-RNA-lösning till varje rör.
När alla material har tillsatts, blanda lösningarna försiktigt och snurra röret innehållet i en bänk-top centrifug i fem sekunder för att sedimentera lösningen. Håll sedan lösningarna till 95 grader Celsius i fem minuter för att skapa ett guide-RNA-komplex följt av 10 minuters nedkylning vid rumstemperatur. För att förbereda ribonukleoprotein komplexa formationer lägga till sex mikroliter av varje guide RNA-lösning och sex mikroliter på 0,5 mikrogram per mikroliter SP-Cas9 nukleas V3 till lämpligt märkta rör.
Efter skonsam blandning, inkubera lösningarna vid 37 grader Celsius i 10 minuter För att göra RNP ribonukleoproteinblandningar för injektion, vid slutet av inkubationen tillsätt fyra mikroliter av varje ribonukleoprotein till lämplig RDL. För att göra en kontroll, no-guide RNA-lösning blanda fyra mikroliter av spårmedel RNA med 92 mikroliter av buffert och fyra mikroliter vatten. Efter tillsats av vatten, hålla lösningen i fem minuter vid 95 grader Celsius och låt blandningen svalna tills den når rumstemperatur.
Blanda sedan sex mikroliter av RNA-lösningen utan guide med sex mikroliter på 0,5 mikrogram per mikroliter Cas9-nukleas V3. För ribonukleoproteinblandningsinjektion, efter att ha fångat enskilda bin i injektionsflaska med ett litet hål i kapsylerna, immobilisera bina i högst tre minuter på is och säkra varje bi i tidigare beredda metallhållare med silvertejp. Med ryggen bröstkorgen, vingar och huvud exponeras. Använd en fem milliliter spruta för att mata bina med en en mola sackaros lösning tills de inte längre hungrig, och placera säkrade bin i en låda med en våt pappershandduk för luftfuktighet.
Därefter placerar du vax på insidan av locken på två 35 milliliter petriskålar och placerar diskens bottnar på vaxet. Injicera en molar sackaros mellan locket och botten av varje maträtt, och placera en utfodring petriskål i vit låda med ett glas diabild och placera den andra i svart låda med ett glas bild. Placera sedan en liten kam i varje låda och ladda ett mikroinjektionssystem med RDL CRISPR-Cas9-blandningen.
För INJEKTION MED RDL CRISPR-Cas9 injicerar du medianen för ocelli av åtta bin med 345 nanoliter av ribonukleoprotein RDL-mix följt av matning med en mol sackaros innan bina frisläpers i den svarta experimentlådan. Mata en andra uppsättning med åtta bin som kontroller utan några injektioner och släpp dem i den vita kontrollboxen. Placera sedan båda lådorna i en polystyrenbehållare med vått papper, observera bina två gånger om dagen för att säkerställa att de har tillräckligt med mat och en god luftfuktighet.
48 timmar efter injektionen, immobilisera bina på is i 30 sekunder och använd sax för att halshugga varje insekt. Placera huvudena i 4%paraformaldehyd i PBS under ett dissekerande mikroskop i en rökhuva, och använd barraquer iris sax för att försiktigt men snabbt ta bort antenner, sammansatta ögon, och den övre exoskelett. Låt huvudena sitta i fixeringslösningen i 10 minuter innan resten av exo-skelettet tas bort från huvudet och all kvarvarande luftstrupe.
Placera sedan varje hjärna i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller minst en milliliter av 4%paraformaldehyd över natten vid fyra till åtta grader Celsius. Nästa morgon, tillsätt 3,8 gram argrose till 50 milliliter destillerat vatten i en erlenmeyer kolv och mikrovågsugn lösningen tills argrose liquifies. Överför tre till fyra fasta honungsbihjärnor till en ny 35 millimeters petriskål och använd mjukpapper för att ta bort överskottet fixativ.
Häll försiktigt vätskan argrose över hjärnorna och orientera proverna inom argrose så att antennerna loberna är vända uppåt. Efter argrose har stelnat, använd en skalpell för att skära ut enskilda block av argrose som innehåller en enda hjärna och fylla varje brunn av en 24-brunnsplatta laddad med en korg med en hydrofoba mesh botten och 600 mikroliter pbs per brunn. Sedan, använd en vibratome till en förvärva 70 mikrometer tvärsnitt av hjärnvävnaden från varje argrose block.
Placera sektionerna från en enda hjärna på nätet av samma korg som de förvärvas. Efter märkning avsnitten med fluorophore konjugerade antikroppar, enligt standardprotokoll, bädda in varje bild med sektioner från en enda hjärna med hjälp av en droppe montering medium och visualisera proverna genom fluorescens mikroskopi. Anti-RDL etiketter neuropils i frontalsektionen av vild-typ, men inte CRISPR-Cas9 RDL knockout bi hjärnor.
En liknande specificitet observerades för anti-mGlutR1 antikroppar. I dessa representativa, kvantitativa PCR drop off tester i bin hjärnor injiceras med RDL CRIPSR-Cas9, den relativa minskningen av fluoresen motsvarade antalet av den modifierade guide DNA i provet. Efter mGlutR1 CRISPR-Cas9-injektion var den relativa modifieringen av guide-DNA cirka 59%i hjärnan hos injicerade bin jämfört med det guide-DNA som observerades i hjärnan hos icke-injicerade bin.
I denna kvantitativa RT-PCR ina separat grupp av bin den relativa minskningen av budbäraren RNA RDL var ungefär 59%jämfört med nivån av RNA hos icke-injicerade bin, och den relativa minskningen av budbäraren mGlutR1 RNA i injicerade bin var cirka 53%Notably, injektionen av RDL CRISPR-Cas9 genom ocelli kanske inte alltid når ett stort antal hjärnceller. Till exempel, i dessa preparat endast en vara av åtta hade RDL CRISPR-Cas9 i stort antal hjärnceller jämfört med andra bi hjärnor. Med RDL CRISPR-Cas9 koncentrerad i protocerebrumets celler, men inte antennalloben.
Se till att undvika fryst och refrost RNA. Var noga med att inte överkyla bina. Utnyttja dem omedelbart när stoppet rör sig i injektionsflaskan.
Denna teknik kan användas för att studera effekterna av minskningen av hämmande jonomtropiska och metabotropiska receptorer i svampkroppen och centrala komplex på honungsbin beteende.