Name: specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00
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Gli autori riconoscono Asifa Akhtar e Angelika Rambold (sia Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) per la fornitura di cellule HeLa.

NOT:</</c0> Tutte le linee cellulari qui menzionate sono state coltivate nel mezzo dell'aquila modificata di alto glucosio (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), glutammina, penicillina / streptomicina, e pyruvate. Erizza tutti i mezzi e gli integratori da utilizzare il giorno dell'etichettatura e dell'imaging riscaldandoli fino a 37 gradi centigradi in un'incubatrice impostata al 5% di CO2. Tutte le colture cellulari, compresa l'etichettatura, si svolgono in condizioni sterili sotto una ...

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures.">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li><li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A.">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013 (2012).</li><li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure.">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li><li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+(TFAM):+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions.">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li><li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells.">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li><li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids.">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li><li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus.">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li><li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).</li><li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM/dSTORM.">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li><li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA.">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li><li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid.">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling.">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li><li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells.">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging.">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li><li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA(+)+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization.">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li><li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining.">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li><li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy.">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).</li></ol>

Ci sono diversi componenti critici per il protocollo: per ottenere un'etichettatura preferenziale del DNA mitocondriale, la concentrazione del tinaccio di legame del DNA durante l'incubazione dovrebbe essere mantenuta molto bassa (ad esempio, una diluizione di 1:10.000 di un tipico stock commerciale), e il tempo di incubazione dovrebbe essere di 30 min. Il tempo di incubazione non deve mai essere superiore a 1 h. si deve usare un tinrio d'oro SYBR; altri coloranti che legano il DNA non sono abbastanza luminosi da generar...

Le molecole circolari di DNA da 16,5 kbp costituiscono il materiale genetico dei mitocondri, codificando 22 tRNA, 2 rRNA e 13 polipeptidi necessari per i complessi di fosforooostiami ossidriali mitocondriali. Il DNA mitocondriale legato al fattore trascrizione mitocondriale a (TFAM) e diverse altre proteine formano i nucleoidi mitocondriali1,2,3,4.4 I nucleoidi mitocondriali si spostano e si ridistribuiscono tra i componenti della rete mitocondriale5,6 durante il suo rimodellamento morfologico, fissione o fusione a seconda della fase del ciclo cellulare, dello stress e di altri fattori (rivisti in Pernas et al.7). Inoltre, il movimento dei nucleoidi mitocondriali, è implicato nellamalattia di 8 del lupus del lupus sistemico e può svolgere un ruolo in altre malattie. La microscopia a fluorescenza è una tecnica semplice per gli studi in cellule vive di organelli, ma la tecnica ha una risoluzione di >200 nm, che è maggiore delle dimensioni dei nucleoidi mitocondriali (100 nm9,10,11,12). Questo limite è stato aggirato con le cosiddette tecniche di "super-risoluzione", come l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED) e la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM)13,14. Finora, i nucleoidi mitocondriali e altri DNA sono stati immagini nelle cellule vive mediante microscopia ottica stocastica diretta (dSTORM)15. Strutture sub-mitocondriali fini con posizioni correlate con mtDNA sono state osservate da STED nelle cellule vive16. Tuttavia, queste tecniche di super-risoluzione richiedono un'elevata intensità di illuminazione, che provoca effetti fototossici sulle cellule viventi17. Pertanto, l'imaging time lapse di nucleoids mitocondriali con risoluzione oltre il limite di diffrazione è impegnativo. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato la microscopia di illuminazione strutturata a super-risoluzione (SR-SIM)18. SIM richiede una dose di potenza di illuminazione molto inferiore rispetto a STED e SMLM19. Inoltre, a differenza delle tecniche STED e SMLM, la SIM consente un semplice imaging tridimensionale multicolore (3D) e non richiede particolari proprietà fotofisiche dei fluorofori o della composizione del buffer di imaging19.
La strategia convenzionale per l'etichettatura dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive è l'etichettatura fluorescente di una proteina nucleoide mitocondriale, come TFAM20. Tuttavia, in molti casi, questa strategia non è adatta. Inoltre, la sovraespressione del TFAM fluorescente con tag proteici produce un grave artefatto21. L'etichettatura del DNA con coloranti organici presenta vantaggi rispetto a una strategia basata su proteine fluorescenti (FP). I coloranti organici sono privi di vincoli legati all'etichettatura fp: possono essere utilizzati per qualsiasi tipo di cellule o tessuti e possono essere applicati in qualsiasi momento di un esperimento. L'imaging cellulare vivo dei nucleoidi mitocondriali è stato segnalato con diversi coloranti leganti il DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,25,26.26 Un sostanziale inconveniente della maggior parte dei coloranti che legano il DNA per l'etichettatura dei nucleoidi è che macchiano tutto il DNA all'interno della cellula. Puntare un tintura esclusivamente al DNA mitocondriale è altamente auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria un'attenta selezione di un colorante che possiede proprietà fisico-chimiche adeguate. I coloranti lipofilici che possiedono una carica positiva delocalizzata, come la rhodamina 123, sono noti per accumularsi nei mitocondri vivi, che conservano il loro potenziale di membrana negativa. Inoltre, un colorante ideale per l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali dovrebbe legare il DNA con un'alta affinità ed emettere fluorescenza luminosa durante il legame del DNA. Considerando questi requisiti, alcune cianine sono promettenti (ad esempio, picoGreen), ma il DNA nucleare è abbondantemente macchiato da questi coloranti contemporaneamente con DNA mitocondriale15,25,26. Il protocollo attuale descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive con un altro colorante cianino, SYBR Gold (SG), e il monitoraggio dei nucleoidi nei video SIM a super-risoluzione time lapse. Inoltre, le cellule vive macchiate di SG possono essere immagini da qualsiasi tipo di microscopio fluorescente invertito (confocale, disco rotante, epifluorescenza, ecc.) adatto per le cellule viventi e dotato di una fonte di luce fluorescente invertita.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high glucose DMEM</td>
			<td>GIBCO/ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 35-mm dish, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 8-well microSlide, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.1</td>
			<td>Bitplane/Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>image porcessing and visualisation software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon 885</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera with back-illuminated sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>laser scanning confocal microscope with array detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker CMXRos Red</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep Red FM</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M22426</td>
			<td>far red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picoGreen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>P7581</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>S11494</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2012 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>image acquisition and processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy

I nucleotidi mitocondriali sono particelle compatte formate da molecole di DNA mitocondriale rivestite di proteine. Il DNA mitocondriale codifica tRNA, rRNA e diversi polipeptidi mitocondriali essenziali. I nucleoidi mitocondriali si dividono e si distribuiscono all'interno della rete mitocondriale dinamica che subisce fissione/fusione e altri cambiamenti morfologici. La microscopia a fluorescenza dal vivo ad alta risoluzione è una tecnica semplice per caratterizzare la posizione e il movimento di un nucleoide. Per questa tecnica, i nucleoidi sono comunemente etichettati attraverso tag fluorescenti dei loro componenti proteici, vale a dire il fattore di trascrizione a (TFAM). Tuttavia, questa strategia ha bisogno di sovraespressione di un costrutto fluorescente con tag proteico, che può causare artefatti (riportati per TFAM) e non è fattibile in molti casi. I coloranti organici che legano il DNA non presentano questi svantaggi. Tuttavia, mostrano sempre una colorazione dei DNA nucleari e mitocondriali, mancando quindi di specificità ai nucleoidi mitocondriali. Tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di tali coloranti, abbiamo selezionato una macchia di gel acido nucleico (SYBR Gold) e ottenuto l'etichettatura preferenziale dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive. Le proprietà del colorante, in particolare la sua elevata luminosità dopo il legame al DNA, permettono la successiva quantificazione del movimento nucleoideto mitocondriale utilizzando serie temporali di immagini di illuminazione strutturata super-risoluzione.

Caratterizzazione dell'etichettatura delle cellule vive con SG In primo luogo, la distribuzione di SG nelle cellule su incubazione con il tinrito a varie diluizioni è stata caratterizzata da microscopia confocale. Dopo l'incubazione con alte concentrazioni di SG o picoGreen, entrambi i coloranti per lo più etichettavano i nuclei e hanno mostrato una colorazione puntato nel citoplasma (Figura 1), analogamente ai dati pubblicati per un alt...

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Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Il protocollo descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali con una macchia di gel di DNA disponibile in commercio, l'acquisizione di una serie di cellule con etichettatura live-lapse mediante microscopia di illuminazione strutturata super-risoluzione (SR-SIM) e tracciamento automatico del movimento nucleoide.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Il protocollo consente l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive e lo studio quantitativo del loro movimento ad alta risoluzione. L'incubazione con il colorante fluorescente ignora solo la necessità di proteine fluorescenti rispetto all'espressione, evitando artefatti e limitazioni correlati e consentendo l'applicazione del nostro protocollo alle cellule non trasflubili. Per ottenere una colorazione nucleoide preferenziale, si dovrebbe usare SYBR Gold e nient'altro nelle condizioni che abbiamo ottimizzato.Altrimenti, il DNA cellulare totale potrebbe essere macchiato. Un giorno prima della procedura di etichettatura, coltura quattro volte 10 alla quinta cellule HeLa in due millilitri di mezzo in una piastra di Petri da 35 millimetri. La mattina seguente, lavare le cellule in due millilitri di PBS prima di aggiungere un millilitro di mezzo di coltura privo di fenolo rosso e un millilitro dell'appropriata soluzione di etichettatura 2X.Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, aspirare accuratamente il colorante contenente supernatante da ogni piastra di Petri di 35 millimetri e lavare le celle con due millilitri di PBS. Quindi nutrire le cellule con un nuovo mezzo di coltura di cellule libere dal fenolo rosso e restituire la coltura all'incubatore di coltura cellulare protetto dalla luce fino all'imaging dal vivo. Per l'imaging a celle vive, almeno un'ora prima della sessione di imaging, posizionare l'incubatore superiore del palco sullo stadio del microscopio ad illuminazione strutturata a super risoluzione e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e la concentrazione di anidride carbonica al 5%Accendere tutti i componenti del microscopio, compresi i laser, e selezionare un obiettivo di immersione ad alta ingrandimento e ad alta apertura numerica come raccomandato per la microscopia ad illuminazione strutturata a super risoluzione dal produttore del microscopio.Quando i laser si sono riscaldati, installare la piastra di Petri di 35 millimetri sullo stadio del microscopio e utilizzare l'oculare per individuare un'area di interesse con celle attaccate al fondo del piatto. Per acquisire immagini di microscopia ad illuminazione strutturata ad altissima risoluzione, utilizzare una fotocamera del dispositivo accoppiato a carica accoppiata di carica elettronica di fascia alta back-end. Nel software di acquisizione delle immagini, impostare un elevato guadagno di moltiplicazione degli elettroni come raccomandato per la fotocamera.Prima di acquisire la serie time lapse per il tracciamento dei nucleoidi, acquisire un'immagine di microscopia ad illuminazione strutturata a due super risoluzione a colori dello stesso campo visivo in un canale per la colorazione mitocondriale e un altro per l'oro SYBR. Impostare il canale di colore dell'immagine mitocondriale sull'eccitazione e l'emissione appropriate per la macchia mitocondriale utilizzata e impostare il filtro di emissione di eccitazione e bang Pass appropriato per il colorante dorato SYBR. Impostare la potenza laser più bassa possibile per entrambi i canali.Se il microscopio acquisisce canali solo in sequenza, spegnere il canale per il rilevamento delle macchie mitocondriali. deselezionare la casella Z-stack nel software per disattivare l'acquisizione dello Z-stack per impostare l'acquisizione di un singolo piano focale e impostare il tempo di esposizione della fotocamera più breve possibile. Impostare tre rotazioni della rete e acquisire immagini bidimensionali delle celle etichettate a diversi valori di potenza laser e più tempi di esposizione per ottimizzare la potenza laser nel tempo di esposizione della fotocamera.Selezionare la potenza laser e i tempi di esposizione della fotocamera che producono immagini di microscopia ad illuminazione strutturata con punti luminosi nei mitocondri con artefatti pochi o nessun artefatto e iniziare l'acquisizione della serie time lapse utilizzando le impostazioni ottimizzate. Per l'analisi delle immagini time lapse, aprire le immagini della microscopia ad illuminazione strutturata convertita e un software di analisi delle immagini appropriato che dispone di un modulo di tracciamento dei punti e fare clic su aggiungi nuovi punti per avviare la creazione guidata punti. Nella scheda Crea fare clic su Traccia punti nel tempo e passare al secondo passaggio della procedura guidata.Impostare il diametro x-y stimato su 0,1 a 0,15 micrometri. Fare clic su sottrazione di sfondo e passare al terzo passaggio della procedura guidata. Trascinare la linea verticale nell'istogramma per regolare la soglia del filtro di qualità fino a quando la maggior parte dei nucleotidi non viene rilevata quando le macchie negli artefatti non vengono rilevate all'interno di ogni fotogramma.Procedere al quarto e quinto passo della procedura guidata e selezionare l'algoritmo di movimento autoregressivo. Impostare la distanza massima su 0,5 micrometri e la dimensione massima dello spazio su zero. Quando i parametri ottimizzati consentono al software di rilevare correttamente tutti i punti e costruire le tracce, fare clic sul pulsante freccia ora per confermare la creazione delle tracce e fare clic sull'icona delle statistiche per estrarre le statistiche delle tracce.Selezionare quindi i parametri statistici necessari e fare clic su Salva con nome per esportare i valori come file CSV punto per la quantificazione e la visualizzazione. L'etichettatura con alte concentrazioni di oro SYBR o PicoGreen si traduce in un'abbondante colorazione dei nuclei e della colorazione del punctato all'interno del citoplasma. A concentrazioni più basse, il debole segnale d'oro SYBR appare all'interno dei nuclei in un modello di punti luminosi si osserva all'interno del citoplasma.L'etichettatura PicoGreen a basse concentrazioni produce principalmente colorazione nucleare. La colorazione simultanea con basse concentrazioni di oro SIBR in un colorante mitocondriale molto rosso rivela che quasi tutta la colorazione dell'oro si bersa si verifica all'interno dei mitocondri mentre l'etichettatura ad alte concentrazioni si traduce in una colorazione significativa dei nuclei e del citoplasma. L'imaging time-lapse rivela che dopo 45 minuti la colorazione nucleoide è vicina alla saturazione.La fissazione provoca una leggera ridistribuzione del colorante al nucleo, mentre la permeablizzazione delle cellule fisse elimina il modello di colorazione punteggiata dei mitocondri e migliora la colorazione nucleare. Se l'oro SYBR viene aggiunto alle cellule dopo la fissazione e la permeablizzazione, il colorante viene distribuito uniformemente attraverso il citoplasma e il nucleo con conseguente perdita della specificità della colorazione. L'imaging 3D a cellule vive mediante microscopio ad illuminazione strutturata a super risoluzione rivela il nucleoide mitocondriale come punti luminosi all'interno dei mitocondri.Tracciare le posizioni del nucleoide ad una risoluzione oltre il limite di diffrazione dimostra che la maggior parte dei nucleoidi mostra movimenti casuali a breve distanza che sono probabilmente confinati alla rete mitocondriale. È importante notare che questo protocollo non è compatibile con la fissazione del campione. Tuttavia, il nostro protocollo dovrebbe essere compatibile con un'ampia gamma di saggi basati sull'imaging di cellule vive per lo studio della morfologia, della dinamica e delle attività di molecole e organelli.Il nostro studio illustra i vantaggi del retargeting dei coloranti non organici per le tecniche a base cellulare. Può ispirare l'esplorazione di altri coloranti fluorescenti per la loro applicazione negli studi cellulari.

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