Name: specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00
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著者らは、HeLa細胞を提供したアシファ・アフタールとアンジェリカ・ランボルト(マックス・プランク免疫生物学・エピジェネティクス研究所の両方)を認めている。

注:ここで言及したすべての細胞株は、10%のウシ胎児血清(FBS)、グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸を添加した高グルコースダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。5%CO2に設定したインキュベーターで37°Cまで温めることにより、ラベリングおよび画像化の日に使用されるすべての培地およびサプリメントを平衡化する。2ラベリングを含むす...

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	<li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures.">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li><li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A.">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013 (2012).</li><li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure.">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li><li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+(TFAM):+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions.">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li><li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells.">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li><li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids.">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li><li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus.">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li><li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).</li><li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM/dSTORM.">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li><li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA.">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li><li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid.">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling.">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li><li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells.">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging.">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li><li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-mitochondria+contacts+couple+mtDNA+synthesis+with+mitochondrial+division+in+human+cells.">ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells.</a> Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).</li><li>Dellinger, M., Geze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+in+living+animal+cells+with+fluorescence+microscopy.">Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).</li><li>Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleoid+structure+regulated+by+mitochondrial+fission+contributes+to+cristae+reformation+and+release+of+cytochrome+c.">Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).</li><li>Zurek-Biesiada, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+of+DNA+in+situ+using+Vybrant((R))+DyeCycle+Violet+fluorescent+probe:+A+new+approach+to+study+nuclear+nanostructure+at+single+molecule+resolution.">Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution.</a> Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).</li><li>He, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA(+)+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization.">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li><li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining.">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li><li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy.">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).</li></ol>

プロトコルにはいくつかの重要な要素があります:ミトコンドリアDNAの優先標識を達成するために、インキュベーション中のDNA結合色素の濃度は非常に低く(例えば、典型的な商業ストックの1:10,000希釈)、およびインキュベーション時間は30分であるべきです。インキュベーション時間は1時間を超えてはならない SYBR ゴールド染料を使用する必要があります。他のDNA結合色素は、低濃度で標識?...

円形の16.5kbp DNA分子はミトコンドリアの遺伝物質を構成し、ミトコンドリア酸化リン酸化複合体に必要な22のtRNA、2つのrRNA、および13のポリペプチドをコードする。ミトコンドリア転写因子a(TFAM)および他のいくつかのタンパク質に結合したミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアヌクレオイド11、2、3、42,3,4を形成する。ミトコンドリア核は、ミトコンドリアネットワーク55、66の成分間で移動し、再分配し、その形態学的改変、分裂または融合は細胞周期相、応力、および他の要因に応じて(Pernas et7.また、ミトコンドリアヌクレオイドの運動は、全身性エリテマトーデス病8に関与し、他の疾患に関与しうる。蛍光顕微鏡は、オルガネラの生細胞研究のための簡単な技術であるが、この技術は、ミトコンドリアヌクレオイドのサイズよりも大きい>200nmの解像度を有する(〜100 nm99、10、11、12)。10,11,12この限界は、刺激放出枯渇(STED)および単一分子局在化顕微鏡(SMLM)13,14のようないわゆる「超解像」技術によって回避された。13,14これまで、ミトコンドリアヌクレオイドおよび他のDNAは、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)15によって生細胞で画像化された。15mtDNAと相関する位置を有する微細なサブミトコンドリア構造は、生細胞16においてSTEDにより観察された。しかしながら、これらの超解像技術は高い照明強度を必要とし、生細胞17に光毒性作用を引き起こす。したがって、回折限界を超える解像度を有するミトコンドリアヌクレオイドのタイムラプスイメージングは困難である。これに対処するために、我々は超解像構造照明顕微鏡(SR-SIM)1818を使用した。SIM は、STED および SMLM19よりもはるかに低い照明電力線量を必要とします。さらに、STEDおよびSMLM技術とは対照的に、SIMは単純な多色三次元(3D)イメージングを可能にし、フルオロフォアまたはイメージングバッファ組成物19の特定の光物性を必要としない。
生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの標識に関する従来の戦略は、TFAM20のようなミトコンドリアヌクレオイドタンパク質の蛍光タグ付けである。しかし、多くの場合、この戦略は適していません。さらに、蛍光タンパク質タグ付きTFAMの過剰発現は、深刻な人工物21を生成する。有機色素によるDNAの標識は、蛍光タンパク質(FP)ベースの戦略よりも優れた効果があります。有機色素はFPタグに関連する制約がない:それらは細胞または組織の任意のタイプに使用することができ、実験の任意の時点で適用することができる。ミトコンドリアヌクレオイドの生細胞イメージングは、いくつかのDNA結合色素で報告されている:DAPI2222、SYBRグリーン23、ヴィブラントDyeCycle24、およびピコグリーン15、25、26。15,25,26ヌクレオイド標識のためのほとんどのDNA結合色素の実質的な欠点は、それらが細胞内のすべてのDNAを染色することです。ミトコンドリアDNAのみに対する色素の標的化は非常に望ましい。そのためには、適切な物理化学的性質を有する色素を慎重に選択することが必要である。ローダミン123のような非局所陽性電荷を有する親油性染料は、その陰性膜電位を保持する生のミトコンドリアに蓄積することが知られている。さらに、ミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識に理想的な色素は、高い親和性を持つDNAを結合し、DNA結合時に明るい蛍光を発する必要があります。これらの要件を考慮すると、特定のシアニン(例えば、ピコグリーン)が有望であるが、核DNAはミトコンドリアDNA15、25、26,25,26と同時にこれらの染料によって豊富に染色される。本プロトコルは、別のシアニン色素を有する生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、SYBR Gold(SG)、および時間経過超解像SIMビデオにおける核oidの追跡について説明する。また、SG染色された生細胞は、生細胞に適したあらゆる種類の反転蛍光顕微鏡(共焦点、紡績円盤、蛍光等)で、488nmの光源を備えて画像化することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high glucose DMEM</td>
			<td>GIBCO/ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 35-mm dish, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 8-well microSlide, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.1</td>
			<td>Bitplane/Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>image porcessing and visualisation software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon 885</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera with back-illuminated sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>laser scanning confocal microscope with array detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker CMXRos Red</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep Red FM</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M22426</td>
			<td>far red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picoGreen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>P7581</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>S11494</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2012 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>image acquisition and processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy

ミトコンドリアヌクレオイドは、ミトコンドリアDNA分子によって形成されるコンパクトな粒子であり、タンパク質で被覆される。ミトコンドリアDNAは、tRNA、rRNA、およびいくつかの必須のミトコンドリアポリペプチドをコードする。ミトコンドリア核は、核分裂/融合および他の形態学的変化を受ける動的ミトコンドリアネットワーク内で分裂し、分布する。高解像度ライブ蛍光顕微鏡は、核酸の位置と動きを特徴付けるための簡単な技術です。この技術では、ヌクレオイドは、一般に、それらのタンパク質成分、すなわち転写因子a(TFAM)の蛍光タグを介して標識される。しかし、この戦略は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の過剰発現を必要とし、アーティファクト(TFAMについて報告)を引き起こす可能性があり、多くの場合実現不可能である。有機DNA結合色素はこれらの欠点を有しない。しかし、彼らは常に核およびミトコンドリアDNAの染色を示し、したがってミトコンドリアヌクレオイドに特異性を欠いている。このような色素の物理化学的性質を考慮して、核酸ゲル染色(SYBR Gold)を選択し、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの優先標識を達成した。色素の特性、特にDNAに結合する際の高輝度は、超解像構造照明画像の時系列を用いてミトコンドリア核体運動のその後の定量化を可能にする。

SGを用いて生細胞ラベリングを特徴づけ まず、種々の希釈液における色素とのインキュベーション時の細胞内のSGの分布は、共焦点顕微鏡によって特徴付けられた。SGまたはpicoGreenの高濃度でインキュベーションした後、両方の染料は主に核を標識し、細胞質にパンクチット染色を示した(図1)、同様に別の正に帯電したシアニン色?...

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Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識と、その運動の高分解能における定量的研究を可能にする。蛍光色素によるインキュベーションは、蛍光タンパク質の必要性をバイパスするだけで、関連するアーティファクトや制限を回避し、トランスフェクト不可能な細胞にプロトコルを適用することができます。優等核の染色を達成するためには、SYBR Goldを使用し、最適化した条件下では何も使用しないでください。さもなければ、全細胞DNAが染色され得る。ラベリング手順の1日前に、35ミリメートルペトリ皿中の培地2ミリリットルで5番目のHeLa細胞に10回10回培養する。翌朝、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄してから、フェノール赤自由培養液1ミリリットルと適切な2Xラベリング溶液の1ミリリットルを添加する。30分37度と5%の二酸化炭素で、上清を含む色素を各35ミリメートルのペトリ皿から慎重に吸引し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗います。次に、新鮮なフェノール赤自由細胞培養培地で細胞を供給し、生きたイメージングまで光から保護された培養インキュベーターに培養液を戻す。ライブセルイメージングの場合、イメージングセッションの少なくとも1時間前に、ステージトップインキュベーターを超解像度の構造照明顕微鏡ステージに配置し、レーザーを含む顕微鏡のすべてのコンポーネントの温度を摂氏37度に、二酸化炭素濃度を5%スイッチに設定し、高倍率、高数値開腹浸漬目的を選択します。レーザーが温まったら、35ミリメートルのペトリ皿を顕微鏡のステージに取り付け、眼を使って皿の底に取り付けられた細胞で関心のある領域を見つけます。超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得するには、バックエンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイスカメラを使用します。画像取得ソフトウェアでは、カメラに推奨される高電子乗算ゲインを設定します。ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、ミトコンドリア染色用の1つのチャネルとSYBR金用の別のチャネルで同じ視野の2色超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得します。ミトコンドリア画像カラーチャネルを、使用するミトコンドリア染色に適した励起と放出に設定し、SYBRゴールド色素に適した励起およびバンパスエミッションフィルタを設定します。両方のチャンネルに可能な限り低いレーザーパワーを設定します。顕微鏡が連続的にチャンネルを取得する場合は、ミトコンドリア染色検出用のチャネルをオフにします。ソフトウェアの Z スタック ボックスのチェックを外して、Z スタックの取得をオフにして単一の焦点面の取得を設定し、カメラの露出時間を最短に設定します。グリッドの3回転を設定し、複数のレーザーパワー値と数回の露出時間でラベル付けされたセルの2次元画像を取得し、カメラの露出時間にレーザーパワーを最適化します。ほとんどまたは全くアーティファクトを持つミトコンドリアの明るいスポットを持つ構造化された照明顕微鏡画像を生成するレーザーパワーとカメラの露出時間を選択し、最適化された設定を使用してタイムラプスシリーズの取得を開始します。タイムラプス画像の解析のために、変換された構造化照明顕微鏡画像とスポットトラッキングモジュールを備えた適切な画像解析ソフトウェアを開き、[新しいスポットを追加]をクリックしてスポット作成ウィザードを開始します。[作成] タブで[時間の経過に従ってスポットを追跡]をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。推定 x-y 直径を 0.1 ~ 0.15 マイクロメートルに設定します。[背景の減算] をクリックし、ウィザードの 3 番目の手順に進みます。ヒストグラムの垂直線をドラッグして、各フレーム内でアーチファクト内のスポットが検出されないとき、大部分のヌクレオチドが検出されるまで、品質フィルタの閾値を調整します。ウィザードの 4 番目と 5 番目の手順に進み、自己回帰モーション アルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 マイクロメートルに、最大ギャップ サイズをゼロに設定します。微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、矢印ボタンをクリックしてトラックの作成を確認し、統計情報アイコンをクリックしてトラックの統計情報を抽出します。次に、必要な統計情報パラメータを選択し、[名前を付けて保存]をクリックして、値をドット CSV ファイルとしてエクスポートして定量化と視覚化を行います。SYBR金またはピコグリーンの高濃度で標識すると、核の豊富な染色と細胞質内の穿刺染色が生じます。より低い濃度では、細胞質内で明るいスポットのパターンで核内にかすかなSYBR金シグナルが現れる。低濃度でのピコグリーン標識は、主に核染色をもたらす。遠赤色ミトコンドリア色素中のSYBR金の低濃度で同時染色すると、SYBR金染色のほとんどすべてがミトコンドリア内で起こり、高濃度で標識すると核および細胞質の有意な染色が生じることが明らかになる。タイムラプスイメージングは、45分後にヌクレオイド染色が飽和に近いことを明らかにします。固定は、固定細胞の透過化はミトコンドリアの点線染色パターンを排除し、核染色を強化しながら、核への色素のわずかな再分配を引き起こす。SYBR金が固定および透過化後に細胞に添加された場合、色素は細胞質と核全体に均一に分布し、染色特異性の損失をもたらす。超分解能構造照明顕微鏡による生細胞3Dイメージングは、ミトコンドリア内の明るいスポットとしてミトコンドリアヌクレオイドを明らかにする。回折限界を超える解像度で核の位置を追跡することは、核の大部分がミトコンドリアネットワークに限定される短距離のランダムな動きを示すことを示しています。このプロトコルはサンプルの固定と互換性がないことに注意することが重要です。しかし、我々のプロトコルは、分子およびオルガネラの形態、ダイナミクスおよび活動の研究のための生細胞画像に基づくアッセイの広い範囲と互換性があるべきである。我々の研究は、細胞ベースの技術のための非有機色素を再標的化することの利点を示している。細胞研究におけるその応用のために他の蛍光色素の探索を促すかもしれない。

Research

JoVE Journal

Biology

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生物学

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