Name: specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00
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Os autores reconhecem Asifa Akhtar e Angelika Rambold (ambos do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética) por fornecer células HeLa.

NOTA: Todas as linhas celulares aqui mencionadas foram cultivadas em alta glicose Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato. Equilibre todos os meios de comunicação e suplementos a serem usados no dia da rotulagem e imagem aquecendo-os até 37 °C em uma incubadora definida para 5% de CO2. Todo o trabalho de cultura celular, incluindo rotulagem, ocorre em condições estéreis sob uma coifa de fl...

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	<li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures.">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li><li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A.">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013 (2012).</li><li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure.">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li><li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+(TFAM):+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions.">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li><li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells.">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li><li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids.">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li><li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus.">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li><li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).</li><li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM/dSTORM.">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li><li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA.">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li><li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid.">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling.">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li><li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells.">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging.">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li><li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA(+)+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization.">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li><li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining.">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li><li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy.">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).</li></ol>

Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em...

Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissão ou fusão, dependendo da fase do ciclo celular, estresse e outros fatores (revisados em Pernas et al.7). Além disso, o movimento dos nucleóides mitocondriais está implicado na doença de lúpus eritematoso sistêmico8 e pode desempenhar um papel em outras doenças. A microscopia de fluorescência é uma técnica simples para estudos de células vivas de organelas, mas a técnica tem uma resolução de >200 nm, que é maior que o tamanho dos nucleóides mitocondriais (~100 nm9,,10,,11,12). Esse limite tem sido contornado pelas chamadas técnicas de "super-resolução", como esgotamento estimulado de emissões (STED) e microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM)13,14. Até agora, nucleóides mitocondriais e outros DNAs foram imagens em células vivas por microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)15. Estruturas submitocínias finas com posições correlacionadas com o dNH foram observadas por DST em células vivas16. No entanto, essas técnicas de super-resolução requerem alta intensidade de iluminação, o que causa efeitos fototóxicos nas células vivas17. Portanto, a imagem de lapso de tempo de nucleóides mitocondriais com resolução além do limite de difração é desafiadora. Para lidar com isso, utilizamos microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM)18. O SIM requer uma dose de energia de iluminação muito menor do que o STED e o SMLM19. Além disso, ao contrário das técnicas STED e SMLM, o SIM permite imagens tridimensionais multicoloridas simples (3D) e não requer propriedades fotofísicas particulares dos fluoroforos ou composição de tampão de imagem19.
A estratégia convencional para rotular nucleóides mitocondriais em células vivas é a marcação fluorescente de uma proteína nucleóide mitocondrial, como a TFAM20. No entanto, em muitos casos, essa estratégia não é adequada. Além disso, a superexpressão do TFAM com proteína fluorescente produz um artefato sério21. A rotulagem de DNA com corantes orgânicos tem vantagens sobre uma estratégia baseada em proteína fluorescente (FP). Os corantes orgânicos são livres de restrições relacionadas à marcação FP: podem ser usados para qualquer tipo de células ou tecidos e podem ser aplicados a qualquer momento de um experimento. Imagens de células vivas de nucleóides mitocondriais foram relatadas com vários corantes de ligação de DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,,25,26. Uma desvantagem substancial da maioria dos corantes de ligação de DNA para rotulagem nucleóide é que eles mancham todo o DNA dentro da célula. Direcionar um corante apenas para DNA mitocondrial é altamente desejável. Para isso, é necessária uma seleção cuidadosa de um corante que possua propriedades físico-químicas adequadas. Corantes lipofílicos que possuem carga positiva deslocalizada, como a rhodamina 123, são conhecidos por se acumularem em mitocôndrias vivas, que preservam seu potencial de membrana negativa. Além disso, um corante ideal para rotulagem específica de nucleóides mitocondriais deve ligar o DNA com alta afinidade e emitir fluorescência brilhante na ligação de DNA. Considerando esses requisitos, certas cianolinas são promissoras (por exemplo, picoGreen), mas o DNA nuclear é abundantemente manchado por esses corantes simultaneamente com DNA mitocondrial15,,25,26. O presente protocolo descreve a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas com outro corante de cianina, SYBR Gold (SG), e rastreamento dos nucleóides em vídeos SIM de super resolução de lapso de tempo. Além disso, as células vivas manchadas de SG podem ser imagens por qualquer tipo de microscópio fluorescente invertido (fusocal, disco giratório, epifluorescência, etc.) adequado para células vivas e equipado com uma fonte de luz de 488 nm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high glucose DMEM</td>
			<td>GIBCO/ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 35-mm dish, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 8-well microSlide, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.1</td>
			<td>Bitplane/Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>image porcessing and visualisation software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon 885</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera with back-illuminated sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>laser scanning confocal microscope with array detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker CMXRos Red</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep Red FM</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M22426</td>
			<td>far red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picoGreen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>P7581</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>S11494</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2012 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>image acquisition and processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy

Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.

Caracterização da rotulagem de células vivas com SG Primeiro, a distribuição de SG nas células após incubação com o corante em várias diluições foi caracterizada por microscopia confocal. Após a incubação com altas concentrações de SG ou picoGreen, ambos os corantes rotularam principalmente os núcleos e apresentaram uma coloração pontual no citoplasma (Figura 1),da mesma forma aos dados publicados para outro corante de ...

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Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

O protocolo permite a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas e o estudo quantitativo de sua moção em alta resolução. A incubação com o corante fluorescente só contorna a necessidade de proteína fluorescente sobre a expressão, evitando artefatos e limitações relacionados e permitindo que nosso protocolo seja aplicado a células não transibrificáveis. Para alcançar a coloração nucleóide preferencial, deve-se usar SYBR Gold e nada mais sob as condições que otimizamos.Caso contrário, o DNA celular total pode estar manchado. Um dia antes do procedimento de rotulagem, cultura quatro vezes 10 para a quinta células HeLa em dois mililitros de médio em uma placa de Petri de 35 milímetros. Na manhã seguinte, lave as células em dois mililitros de PBS antes de adicionar um mililitro de meio de cultura livre de fenol vermelho e um mililitro da solução de rotulagem 2X apropriada.Após 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, aspire cuidadosamente o corante contendo supernanato de cada placa de Petri de 35 milímetros e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, alimente as células com meio de cultura celular livre de fenol fresco e devolva a cultura à incubadora de cultura celular protegida da luz até a imagem viva. Para imagens de células vivas, pelo menos uma hora antes da sessão de imagem, coloque a incubadora superior do palco no estágio do microscópio de iluminação estruturada de super resolução e coloque a temperatura em 37 graus Celsius e a concentração de dióxido de carbono em 5% Ligue todos os componentes do microscópio, incluindo os lasers, e selecione uma alta ampliação, objetivo de imersão de alta abertura numérica, conforme recomendado para microcópia estruturada de super resolução pelo fabricante do microscópio.Quando os lasers tiverem aquecido, instale a placa de Petri de 35 milímetros no estágio do microscópio e use os oculares para localizar uma área de interesse com células presas ao fundo do prato. Para adquirir imagens de microscopia de iluminação estruturada de super resolução, use uma câmera de dispositivo de multiplicação de elétrons high-end de extremidade traseira acoplado. No software de aquisição de imagens, defina um alto ganho de multiplicação de elétrons conforme recomendado para a câmera.Antes de adquirir a série time lapse para rastreamento nucleóide, adquira uma imagem de microscopia de iluminação estruturada de duas cores do mesmo campo de visão em um canal para coloração mitocondrial e outro para ouro SYBR. Defina o canal de cores de imagem mitocondrial para a excitação e emissão adequadas para a mancha mitocondrial utilizada e defina o filtro de emissão de excitação e bang pass apropriado para o corante de ouro SYBR. Defina a menor potência laser possível para ambos os canais.Se o microscópio adquirir canais apenas sequencialmente, desligue o canal para a detecção de manchas mitocondriais. untick a caixa Z-stack no software para desligar a aquisição de pilha Z para definir a aquisição de um único plano focal e definir o menor tempo de exposição da câmera possível. Defina três rotações da grade e adquira imagens bidimensionais das células rotuladas a vários valores de potência laser e vários tempos de exposição para otimizar a potência do laser no tempo de exposição da câmera.Selecione os tempos de exposição de energia a laser e câmera que produzem imagens estruturadas de microscopia de iluminação com pontos brilhantes nas mitocôndrias com pouco ou nenhum artefato e inicie a aquisição da série de lapsos de tempo usando as configurações otimizadas. Para análise das imagens de lapso de tempo, abra as imagens de microscopia de iluminação estruturada convertida e um software apropriado de análise de imagem que tenha um módulo de rastreamento de manchas e clique em adicionar novos pontos para iniciar o assistente de criação de pontos. Na guia criar, clique em rastrear pontos ao longo do tempo e proceda para a segunda etapa do assistente.Defina o diâmetro x-y estimado para 0,1 a 0,15 micrômetros. Clique em subtração de fundo e prossiga para o terceiro passo no assistente. Arraste a linha vertical no histograma para ajustar o limiar do filtro de qualidade até que a maioria dos nucleotídeos sejam detectados, pois as manchas nos artefatos não são detectadas dentro de cada quadro.Vá para o quarto e quinto passos do assistente e selecione o algoritmo de movimento autoregressivo. Ajuste a distância máxima para 0,5 micrômetros e o tamanho máximo da abertura a zero. Quando os parâmetros ajustados permitem que o software detecte todos os pontos e construa faixas corretamente, clique no botão seta agora para confirmar a criação das faixas e clique no ícone estatístico para extrair as estatísticas de faixas.Em seguida, selecione os parâmetros estatísticos necessários e clique em Salvar Como exportar os valores como arquivos de ponto CSV para quantificação e visualização. A rotulagem com altas concentrações de ouro SYBR ou PicoGreen resulta em coloração abundante dos núcleos e coloração pontual dentro do citoplasma. Em concentrações mais baixas, o sinal de ouro SYBR fraco aparece dentro dos núcleos em um padrão de pontos brilhantes é observado dentro do citoplasma.A rotulagem picogreen em baixas concentrações produz principalmente manchas nucleares. A coloração simultânea com baixas concentrações de ouro SYBR em um corante mitocondrial muito vermelho revela que quase toda a mancha de ouro SYBR ocorre dentro das mitocôndrias enquanto a rotulagem em altas concentrações resulta em manchas significativas dos núcleos e citoplasma. A imagem do Time-Lapse revela que após 45 minutos a coloração nucleóide está perto da saturação.A fixação causa uma leve redistribuição do corante para o núcleo, enquanto a permeablização das células fixas elimina o padrão de coloração pontilhada das mitocôndrias e aumenta a coloração nuclear. Se o ouro SYBR é adicionado às células após fixação e permeablização, então o corante é distribuído uniformemente através do citoplasma e do núcleo resultando na perda da especificidade da coloração. Imagens 3D de células vivas por microscópio de iluminação estruturada de super resolução revelam o nucleóide mitocondrial como pontos brilhantes dentro das mitocôndrias.Rastrear as posições do nucleóide em uma resolução além do limite de difração demonstra que a maioria dos nucleóides apresentam movimentos aleatórios de curta distância que provavelmente estão confinados à rede mitocondrial. É importante notar que este protocolo não é compatível com a fixação da amostra. No entanto, nosso protocolo deve ser compatível com uma ampla gama de ensaios baseados em imagens de células vivas para estudo de morfologia, dinâmica e atividades de moléculas e organelas.Nosso estudo ilustra as vantagens de redirecionar corantes não orgânicos para técnicas baseadas em células. Pode inspirar a exploração de outros corantes fluorescentes para sua aplicação em estudos celulares.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

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Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

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Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

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Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

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Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...