Name: specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy at JoVE.com

Författarna erkänner Asifa Akhtar och Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology och Epigenetics) för att tillhandahålla HeLa celler.

OBS: Alla cellinjer som nämns här var odlade i hög glukos Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), glutamin, penicillin/streptomycin och pyruvat. Jämvikt alla medier och kosttillskott som ska användas på dagen för märkning och bildbehandling genom uppvärmning av dem upp till 37 °C i en inkubator inställd på 5% CO2. Alla cellodlingsarbeten inklusive märkning sker under sterila förhållanden under en laminär flödeshuva.
<p...

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures.">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li><li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A.">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013 (2012).</li><li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure.">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li><li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+(TFAM):+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions.">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li><li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells.">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li><li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids.">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li><li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus.">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li><li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).</li><li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM/dSTORM.">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li><li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA.">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li><li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid.">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling.">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li><li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells.">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging.">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li><li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-mitochondria+contacts+couple+mtDNA+synthesis+with+mitochondrial+division+in+human+cells.">ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells.</a> Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).</li><li>Dellinger, M., Geze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+in+living+animal+cells+with+fluorescence+microscopy.">Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).</li><li>Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleoid+structure+regulated+by+mitochondrial+fission+contributes+to+cristae+reformation+and+release+of+cytochrome+c.">Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).</li><li>Zurek-Biesiada, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+of+DNA+in+situ+using+Vybrant((R))+DyeCycle+Violet+fluorescent+probe:+A+new+approach+to+study+nuclear+nanostructure+at+single+molecule+resolution.">Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution.</a> Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).</li><li>He, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA(+)+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization.">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li><li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining.">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li><li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy.">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).</li></ol>

Det finns flera kritiska komponenter till protokollet: För att uppnå förmånlig märkning av mitokondriellt DNA bör koncentrationen av DNA-bindningsfärgen under inkubationen hållas mycket låg (t.ex. en 1:10 000 utspädning av ett typiskt kommersiellt lager) och inkubationstiden bör vara 30 min. Inkubationstiden får aldrig överstiga 1 h. SYBR Guldfärgämne bör användas. andra DNA-bindande färgämnen är inte tillräckligt ljusa för att generera en stark signal vid märkning vid låg koncentration.
<p cl...

Cirkulär 16,5 kbp DNA-molekyler utgör det genetiska materialet i mitokondrierna, kodning 22 tRNAs, 2 rRNAs och 13 polypeptider som behövs för mitokondriellt oxidativa fosforylering komplex. Mitokondriellt DNA bundet till mitokondriell transkriptionsfaktor a (TFAM) och flera andra proteiner bildar mitokondriella nukleoider1,2,3,4. Mitokondriella nukleoider flyttar och omfördelar mellan komponenterna i mitokondriellt nätverk5,,6 under sin morfologiska ombyggnad, fission eller fusion beroende på cellcykelfas, stress och andra faktorer (ses över i Pernas et al.7). Dessutom är rörelsen av mitokondriella nukleoider, inblandad i systemisk lupus erythematosus sjukdom8 och kan spela en roll i andra sjukdomar. Fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för levande cellstudier av organeller, men tekniken har en upplösning på >200 nm, vilket är större än storleken på mitokondriella nukleoider (~100 nm9,10,11,12). Denna gräns har kringgåtts av så kallade "super-resolution" tekniker, såsom stimulerad utsläpp utarmning (STED) och enda molekyllokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Hittills har mitokondriella nukleoider och andra DNA avbildas i levande celler av direkt stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM)15. Fina submitokondriella strukturer med positioner som korrelerar med mtDNA observerades av STED i levande celler16. Dessa superupplösningstekniker kräver dock hög belysningsintensitet, vilket orsakar fototoxiska effekter på levande celler17. Därför är time lapse imaging av mitokondriella nukleoider med upplösning bortom diffraktion gränsen utmanande. För att åtgärda detta använde vi superupplösningsstrukturerad belysningsmikroskopi (SR-SIM)18. SIM kräver en mycket lägre belysning effekt dos än STED och SMLM19. Dessutom tillåter SIM, i motsats till STED- och SMLM-tekniker, enkel tredimensionell (3D) bildbehandling med flera färger, och det kräver inte särskilda fotofysiska egenskaper hos fluoroforeerna eller bildbuffertkompositionen19.
Den konventionella strategin för märkning mitokondriell nukleoider i levande celler är fluorescerande märkning av ett mitokondriellt nukleoidprotein, såsom TFAM20. I många fall är dock denna strategi inte lämplig. Dessutom ger överuttryck av fluorescerande protein-märktA TFAM en allvarlig artefakt21. Märkning av DNA med organiska färgämnen har fördelar jämfört med en fluorescerande protein (FP)-baserad strategi. Organiska färgämnen är fria från begränsningar relaterade till FP-märkning: de kan användas för alla typer av celler eller vävnader och kan tillämpas när som helst i ett experiment. Live cell imaging av mitokondriellt nukleoider har rapporterats med flera DNA-bindande färgämnen: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, och picoGreen15,25,26. En betydande nackdel med de flesta DNA-bindande färgämnen för nukleoid märkning är att de färga alla DNA i cellen. Inriktning ett färgämne enbart till mitokondriellt DNA är mycket önskvärt. För att uppnå detta är noggrant urval av ett färgämne som har lämpliga fysikalisk-kemiska egenskaper nödvändigt. Lipofila färgämnen som har delocalized positiv laddning, såsom rhodamin 123, är kända för att ackumuleras i levande mitokondrierna, som bevarar deras negativa membran potential. Dessutom bör ett idealiskt färgämne för specifik märkning av mitokondriella nukleoider binda DNA med hög affinitet och avge ljus fluorescens på DNA-bindning. Med tanke på dessa krav är vissa cyaniner lovande (t.ex. picoGreen), men kärn-DNA färgas rikligt av dessa färgämnen samtidigt med mitokondriellt DNA15,25,26. Det nuvarande protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler med en annan cyanin färgämne, SYBR Gold (SG), och spårning av nukleoider i tid förfaller super-upplösning SIM videor. Dessutom kan SG-färgade levande celler avbildas av alla typer av inverterad fluorescerande mikroskop (konfokal, snurrande skiva, epifluorescens, etc.) lämplig för levande celler och utrustade med en 488 nm ljuskälla.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high glucose DMEM</td>
			<td>GIBCO/ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 35-mm dish, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi 8-well microSlide, glass bottom</td>
			<td>Ibidi Gmbh</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.1</td>
			<td>Bitplane/Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>image porcessing and visualisation software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon 885</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>EMCCD camera with back-illuminated sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>laser scanning confocal microscope with array detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker CMXRos Red</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep Red FM</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>M22426</td>
			<td>far red live cell mitochondrial stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picoGreen</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>P7581</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>S11494</td>
			<td>cell permeant DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2012 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>image acquisition and processing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific labeling of mitochondrial nucleoids for time-lapse structured illumination microscopy

Mitokondriella nukleoider är kompakta partiklar som bildas av mitokondriella DNA-molekyler belagda med proteiner. Mitokondriellt DNA kodar tRNAs, rRNAs och flera viktiga mitokondriella polypeptider. Mitokondriella nukleoider dela upp och distribuera inom den dynamiska mitokondriellt nätverk som genomgår fission / fusion och andra morfologiska förändringar. Högupplöst levande fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för att karakterisera en nukleoid position och rörelse. För denna teknik, nukleoider är vanligen märkta genom fluorescerande taggar av deras proteinkomponenter, nämligen transkriptionsfaktor a (TFAM). Emellertid, denna strategi behöver överuttryck av en fluorescerande protein-taggade konstruktion, som kan orsaka artefakter (rapporteras för TFAM), och är inte möjligt i många fall. Organiska DNA-bindande färgämnen har inte dessa nackdelar. Men de visar alltid färgning av både nukleära och mitokondriella DNAs, vilket saknar specificitet till mitokondriella nukleoider. Genom att ta hänsyn till de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos sådana färgämnen, valde vi en nukleinsyra gel fläck (SYBR Gold) och uppnått förmånlig märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler. Egenskaper hos färgen, särskilt dess höga ljusstyrka vid bindning till DNA, tillåter efterföljande kvantifiering av mitokondriell nukleoid rörelse med hjälp av tidsserier av super-upplösning strukturerad belysning bilder.

Karakterisering av levande cellmärkning med SG För det första kännetecknades fördelningen av SG i cellerna vid inkubation med färgämnet vid olika utspädningar av konfokalmikroskopi. Efter inkubation med höga koncentrationer av SG eller picoGreen, båda färgämnen mestadels märkt atomkärnor och visade en punktat färgning i cytoplasman (figur 1), på samma sätt som publicerade data för en annan positivt laddad cyanin färgämn...

Watch this Scientific Journal Video about Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy at JoVE.com

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriell nukleoider med en kommersiellt tillgängliga DNA gel fläck, förvärv av time lapse serie levande märkta celler av super-upplösning strukturerad belysning mikroskopi (SR-SIM), och automatisk spårning av nukleoid rörelse.

Specifik märkning av mitokondriella nukleoider för time-lapse strukturerad belysning mikroskopi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Protokollet tillåter specifik märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler och den kvantitativa studien av deras rörelse med hög upplösning. Inkubation med fluorescerande färgämnet kringgår endast behovet av fluorescerande protein över uttryck, undvika relaterade artefakter och begränsningar och gör att vårt protokoll som skall tillämpas på icke-transfectable celler. För att uppnå förmånlig nukleoid färgning, bör man använda SYBR Gold och inget annat under de förhållanden som vi har optimerat.I annat fall kan totalt cellulärt DNA färgas. En dag före märkningsproceduren, kultur fyra gånger 10 till den femte HeLa celler i två milliliter medium i en 35-millimeters Petriskål. Nästa morgon, tvätta cellerna i två milliliter PBS innan du lägger till en milliliter av fenol röd fri odling medium och en milliliter av lämplig 2X märkning lösning.Efter 30 minuter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid aspirerar försiktigt färgämnet som innehåller supernatant från varje 35-millimeters petriskål och tvättar cellerna med två milliliter PBS. Mata sedan cellerna med färskt fenolrött fritt cellodlingsmedium och återföra kulturen till cellodlingsinkubatorn som skyddas från ljus fram till live avbildning. För live cell imaging, minst en timme före bildbehandling session, placera scenen översta inkubatorn på super upplösning strukturerad belysning mikroskop skede och ställa in temperaturen till 37 grader Celsius och koldioxidkoncentrationen till 5%Slå på alla komponenter i mikroskopet inklusive lasrar och välj en hög förstoring, hög numerisk bländare nedsänkning mål som rekommenderas för Super upplösning strukturerad belysning mikroskop av mikroskoptillverkaren.När lasrarna har värmts upp, installera 35-millimeters Petriskål på mikroskopet scenen och använda okulär för att lokalisera ett område av intresse med celler som är knutna till botten av skålen. För att förvärva super upplösning strukturerad belysning mikroskopi bilder, använd en back end high end elektron multiplicera laddning kopplade enheten kamera. I bildförvärvsprogramvaran, ställ in en hög elektron multiplying gain som rekommenderas för kameran.Innan förvärva time lapse-serien för nukleoid spårning, förvärva en två färg super upplösning strukturerad belysning mikroskopi bild av samma synfält i en kanal för mitokondriell färgning och en annan för SYBR guld. Ställ in den mitokondriella bildfärgkanalen på lämplig excitation och emission för den mitokondriella fläck som används och ställ in lämpligt excitations- och bangPass-utsläppsfilter för SYBR-guldfärgen. Ställ in lägsta möjliga lasereffekt för båda kanalerna.Om mikroskopet förvärvar kanaler endast sekventiellt, stäng av kanalen för den mitokondriella fläckdetektionen. untick Z-stack rutan i programvaran för att stänga av Z-stack förvärvet att ställa in förvärvet av en enda fokalplan och ställa in kortast möjliga kamera exponeringstid. Ställ in tre rotationer av nätet och skaffa tvådimensionella bilder av de märkta cellerna vid flera lasereffektvärden och flera exponeringstider för att optimera lasereffekten i kamerans exponeringstid.Välj de lasereffekt och kamerans exponeringstider som ger strukturerade belysningsmikroskopibilder med ljusa fläckar i mitokondrierna med lite eller inga artefakter och starta förvärvet av time lapse-serien med hjälp av de optimerade inställningarna. För analys av time lapse bilder, öppna den konverterade strukturerad belysning mikroskopi bilder och en lämplig bild analys programvara som har en plats spårningsmodul och klicka lägga till nya fläckar för att starta upp fläckar skapande guiden. Under fliken skapa klickar du på spårfläckar över tiden och fortsätter till det andra steget i guiden.Ställ in den uppskattade x-y diametern till 0,1 till 0,15 mikrometer. Klicka på subtraktion i bakgrunden och gå vidare till det tredje steget i guiden. Dra den lodräta linjen i histogrammet för att justera tröskeln för kvalitetsfiltret tills majoriteten av nukleotider identifieras som fläckar i artefakterna inte upptäcks inom varje ram.Fortsätt till den fjärde och femte stegen i guiden och välj den autoregressiva rörelsealgoritmen. Ställ in maxavståndet på 0,5 mikrometer och max gapstorleken till noll. När de finjusterade parametrarna tillåter programvaran att upptäcka alla fläckar och bygga spår korrekt, Klicka på pilen nu knappen för att bekräfta skapandet av spåren och klicka på statistikikonen för att extrahera spåren statistik.Välj sedan nödvändiga statistikparametrar och klicka på Spara som för att exportera värdena som dot CSV-filer för kvantifiering och visualisering. Märkning med höga koncentrationer av SYBR guld eller PicoGreen resulterar i riklig färgning av atomkärnor och punktat färgning inom cytoplasman. Vid lägre koncentrationer visas svag SYBR-guldsignal inom kärnorna i ett mönster av ljusa fläckar observeras inom cytoplasman.PicoGrön märkning vid låga koncentrationer ger mestadels nukleär färgning. Samtidig färgning med låga koncentrationer av SYBR guld i en långt röd mitokondriellt färgämne avslöjar att nästan alla SYBR guld färgning sker inom mitokondrierna medan märkning vid höga koncentrationer resulterar i betydande färgning av kärnor och cytoplasma. Time-Lapse imaging avslöjar att efter 45 minuter nukleoid färgning är nära mättnad.Fixering orsakar en liten omfördelning av färgämnet till kärnan, medan permeablisering av de fasta cellerna eliminerar den prickade färgning mönster av mitokondrierna och förbättrar den nukleära färgning. Om SYBR guld läggs till cellerna efter fixering och permeablisering, då färgämnet är fördelat enhetligt över cytoplasman och kärnan vilket resulterar i förlust av färgning specificitet. Live cell 3D-avbildning genom super upplösning strukturerad belysning mikroskop avslöjar mitokondriellt nucleoid som ljusa fläckar inom mitokondrierna.Spåra positioner nukleoid vid en upplösning utöver diffraktion gränsen visar att majoriteten av nukleoider uppvisar kort distans slumpmässiga rörelser som förmodligen är begränsade till mitokondriellt nätverk. Det är viktigt att notera att detta protokoll inte är kompatibelt med fixeringen av provet. Vårt protokoll bör dock vara kompatibelt med ett brett spektrum av levande cell imaging baserade analyser för studier av morfologi, dynamik och aktiviteter av molekyler och organeller.Vår studie illustrerar fördelarna med retargeting icke-organiska färgämnen för cellbaserade tekniker. Det kan inspirera utforskning av andra fluorescerande färgämnen för deras tillämpning i cellulära studier.

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Användning av Time Lapse mikroskopi för att visualisera Anoxia-inducerad skendöd i<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryon

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av Kraniofaciala utveckling i sox10: Kaede Transgena Zebrafish Linje Använda Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video Mikroskopi för bedömning av EYFP-Parkin Aggregation som en markör för Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En mångsidig metod för montering av Arabidopsis lämnar för Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...