Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور دانيال بالداسار، سوني أوسووغو على المناقشات والتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من منح رايس كريك المنتسبة، أوغويغو؛ منح التحدي سوني أوسويوغو والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المنح الصغيرة إلى PGL وJG.

ملاحظة: تم جمع السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض المستخدمة في هذه الدراسة خلال موسم التعشيش من مايو حتى يونيو 2015-16 من محطة رايس كريك الميدانية، أوغويغو نيويورك بإذن تم الحصول عليها من وزارة البيئة في ولاية نيويورك الحفظ (DEC).
1. طريقة التجفيف الكيميائي لمعالجة الأجنة لSEM
<ol>...

في دراستنا، تم اختبار عوامل التثبيت المختلفة، وطرق الجفاف والتجفيف لإعداد ثلاث عينات بيولوجية حساسة مختلفة لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض، والثقافات الفطرية. يستخدم SEM عادة لتحليل السطح، لذلك الاختراق المثبت هو أقل فيما يتعلق، ولكن يجب أن يكون مفهوما أن الهياكل الداخلية الثابتة سيئة سوف يس...

المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.عند تفسير الصور SEM من العينات البيولوجية، فإنه من التحدي الكبير للتمييز بين الهياكل الأصلية والقطع الأثرية التي يتم إنشاؤها أثناء المعالجة. يتم تشغيل SEM عموما في فراغات عالية جدا لتجنب أي تدخل من جزيئات الغاز التي تؤثر على الحزم الإلكترونية الأولية أو الثانوية أو المتناثرة من العينة10،11. كما أن المواد البيولوجية معرضة للتلف الإشعاعي بسبب خصائصها السيئة أو غير المنضوية. فمن الضروري للعينات المحملة في SEM أن تكون جافة تماما وخالية من أي ملوثات عضوية للقضاء على أي outgassing ممكن في بيئة فراغ عالية10،11. وبما أن العينات البيولوجية تتألف في معظمها من الماء، فإن هناك حاجة إلى تقنيات وقائية إضافية لضمان الاحتفاظ بالهياكل الأصلية.
ويستند القرار الذي تم الحصول عليه إلى تحسين أساليب الإعداد الخاصة بأنواع العينات والمعلمات الآلية المستخدمة. وبالتالي، فمن الضروري تجنب استخدام خطوات المعالجة المعممة لجميع أنواع الأنسجة. وستحتاج بعض العينات البيولوجية إلى معالجة أقل صرامة للحفاظ على هيكلها، في حين قد يلزم مزيد من الوقت والرعاية لأنواع دقيقة من العينات لتجنب إدخال قطع التجفيف، مثل الانكماش والانهيار. إعداد العينة هو خطوة حاسمة في التصوير SEM; نتائج الدراسات المورفومترية تتأثر بشكل ملحوظ بإجراءات إعداد العينات12،13. خطوات التحضير الشائعة للعديد من العينات البيولوجية هي التثبيت والجفاف والطلاء مع معدن مثل الذهب أو البلاتين أو البلاديوم لتحويل أسطحها لتكون موصلة لتحليل SEM. وتختلف طبيعة الخطوات المستخدمة ومزيجها حسب نوع الأنسجة والأهداف المحددة للدراسة. زيادة تهمة، والحساسية للفراغ والضرر شعاع الإلكترون تشكل مشاكل عند معالجة عينات البيولوجية الحساسة لينة، مما يتطلب خطوات معالجة إضافية للحفاظ على الهيكل الأصلي للكائن. استخدام الأساليب التقليدية مثل تحديد تتروكسيد أوزميوم، والجفاف يسبب انكماش وانهيار الأنسجة الحساسة14،15،16،17. والهدف من الدراسة هو وضع منهجيات أنيقة مستمدة من الجمع بين الأفكار من الدراسات السابقة مع التعديلات لإعداد وصورة الأنسجة الحساسة الناعمة (على سبيل المثال، أجنة الزواحف، قشر البيض من السلاحف المطلية، والثقافات الفطرية).
اختيار طريقة تحديد مناسبة هي الخطوة الأولى الأكثر أهمية للتحليل المجهري للعينات البيولوجية. إصلاح الأنسجة مباشرة بعد عزل من كائن حي أمر ضروري لمنع التغيير في مورفولوجيا بسبب التحلل. يجب على المثبت الفعال إنهاء العمليات الخلوية عن طريق permeating الخلايا بسرعة والحفاظ على تأثير لا رجعة فيه لتحقيق الاستقرار في هيكل العينة لتحمل كل من خطوات المعالجة اللاحقة والفحص تحت SEM17 , 18.على الرغم من أن العديد من أساليب التثبيت الكيميائي والفيزيائي معروفة، والتثبيت الكيميائي هو أكثر شيوعا للعينات البيولوجية لتجنب أي تغييرات الخلوية بسبب الانهاليس التلقائي، وتعفن، وآثار التجفيف. هناك العديد من التركيبات الكيميائية المثبتة التي نوقشت في الأدب17،19،20،21،22،23،المثبتات التي تعمل عن طريق denaturing و تخثر الجزيئات البيولوجية، وتلك التي تصلح من خلال الجزيئات الكبيرة عبر التشابك بشكل مشترك. وتستخدم المشروبات الكحولية كالمثبتات denaturing التي تحافظ على البنية الفائقة سيئة جدا وتستخدم في الغالب للميكروسكوب الخفيفة ولا ينصح لتحليل مجهري الإلكترون. المثبتات عبر ربط مثل الفورمالديهايد، الجلوتارهايد، وأوستروكسيد الأوميوم خلق الترابط بين الجزيئية وداخل الجزيئية بين الجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة، وتوفير الحفاظ ممتازة من الهياكل الفائقة11 ،24،25،26. العينات البيولوجية حساسة لدرجة الحرارة. ينصح درجة الحرارة في بداية التثبيت أن تكون 4 درجة مئوية للحد من الحركة الجانبية للبروتينات الغشاء، لإبطاء انتشار الجزيئات بين الخلايا، وإبطاء معدل التثبيت11. الوقت اللازم لإصلاح الأنسجة يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والسرعة التي ينتشر المثبت ويتفاعل مع مكونات العينة. تثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde أو 3٪ الجلوتالالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية هو الأسلوب المفضل لتحليل SEM من العينات المستخدمة في هذه الدراسة لخصائصها اختراقية متسلسلة، والتي تسمح عينات حساسة أصغر ليتم معالجتها17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 27-وزيدت خطوة ما بعد التثبيت مع تتزاز الأوميوم ليس فقط بسبب طبيعته السامة ولكن أيضاً تبين أنه لا يطبق أي ميزة إضافية لتحسين جودة الصورة للعينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة.
تحتوي العينات البيولوجية على سوائل تتداخل مع عملية SEM؛ وبالتالي، فإن العينات تحتاج إلى أن تجفف قبل إدراجه في غرفة عينة SEM. بمجرد ضمان الجفاف، يجب إزالة المذيب من الأنسجة دون إنشاء القطع الأثرية في العينات بسبب التوتر السطحي / التجفيف. وكانت هناك ثلاث طرق تجفيف مختلفة تستخدم عادة أثناء معالجة الأنسجة لتصوير SEM: تجفيف الهواء، وتجفيف نقطة حرجة، وتجميد عينات التجفيف28،29،30،31. عدد قليل من الدراسات تقرير جميع أساليب التجفيف الثلاثة التي تنتج نتائج متطابقة مع عينات الأنسجة الحيوانية28،29،30،31. ومن الممارسات العامة المستخدمة في العينات الصغيرة الجفاف الكيميائي عن طريق سلسلة تركيز تصاعدية من الكحول وسداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS)، ولكن يتم تجفيف عينات أكبر باستخدام أداة تجفيف نقطة حرجة (CPD)32. خلال عملية التجفيف، شكلت قوى كبيرة في تجاويف صغيرة التي يتم تمريرها من خلال العينة عن طريق واجهة السائل / الغاز؛ هذا يمكن أن يؤدي حتى إلى انهيار كامل للهياكل جوفاء33. ويمكن عندئذ أن يخطئ أي تشوه يحدث بسبب العلاج كسمة هيكلية أصلية للعينة. وبالتالي، ينبغي القضاء على الظاهرة المعممة للمعالجة، وينبغي توحيد عملية تجفيف فريدة من نوعها لكل نوع من الأنسجة خاصة عندما يتم تحليل عينات الأنسجة الحساسة.
في العديد من التجارب التي أجريت باستخدام مزيج مختلف من جميع العمليات المذكورة أعلاه، قمنا بتوحيد الأساليب التي يمكن استخدامها لتحليل SEM لثلاثة أنسجة حساسة: أجنة الزواحف، وقذائف البيض من السلاحف المرسومة، والثقافات الفطرية. يصف علماء الأحياء التنموية وعلماء المورفولوجيا التكوين الطبيعي وغير الطبيعي أثناء نمو الأجنة في الحيوانات الفقارية التمثيلية. تعتمد التحقيقات في مسارات الإشارات الجينية على الوصف المورفولوجي للهياكل الجديدة. لتجنب أي تغيير مفاجئ في بنية الأجنة الفقارية أثناء تحليل SEM، نوصي بالتجفيف الكيميائي بعد الجفاف. التجفيف الكيميائي باستخدام HMDS هو أحدث طريقة تجفيف نسبيا وتشمل المزايا السرعة النسبية، وسهولةالاستخدام، وفقدان التكلفة، والخبرة المحدودة والمعدات اللازمة 9. CPD هو تقنية التجفيف شائعة الاستخدام باستخدام تمرير ثاني أكسيد الكربون2 عبر العينات في درجة حرارة والضغط محددة. لقد حددنا أن HMDS مناسب لتجفيف الأنسجة الحساسة الناعمة ويسمح بمعالجة عينات أكبر مقارنة بتجفيف النقاط الحرجة، مما تسبب في تشوه واسع النطاق للأنسجة الجنينية. وقد استخدمت عدة طرق لإعداد عينات لتصوير SEM لدراسة الخصائص المورفولوجية للفطريات34. يتم إصلاح العينات الفطرية عادة في تتزاز أوزميوم تليها جفاف الإيثانول وتجفيف نقطة حرجة، والتي قد توفر نتائج مرضية، على الرغم من أن الآثار السامة لأكسيد الأوساميوم6و7و35 وفقدان المواد الفطرية أثناء تغيير الحلول أثناء المعالجة هي عيوب واضحة. كما تم ممارسة تقنية إعداد العينات باستخدام تجفيف الهواء دون تثبيت36 ولكن النتائج في هياكل تقلصت ومطوية، ومراقبة مثل هذه العينات يمكن بسهولة أن يساء تفسيرها مع تميز الأنواع. الهيفا الفطرية يفقد سلامتها في الاتصال مع السوائل وحتى التجفيف قد لا يتحقق لاستعادة الهيكل. ونتيجة لهذا الغرض، يستخدم تجميد التجفيف عادة لتجفيف الأنسجة الرخوة مثل الميسليوم الفطري. تجميد التجفيف يعمل بشكل جيد للمواد النظيفة ولكن وجود أي أملاح أو إفراز سوف تحجب التفاصيل السطحية التي سيتم تحديدها فقط في مرحلة مشاهدة SEM. نحن جنبا إلى جنب مع طريقة ثقافة الشريحة مع إصلاح الجلوتارهايد والتجفيف نقطة حرجة لإنتاج التفاصيل الهيكلية من الهيبهاي الفطرية سليمة والجراثيم. على الرغم من أن تجفيف CPD تسبب انكماش في الأجنة، أدى إلى هياكل مسيليال الحفاظ عليها بشكل جيد عندما يقترن تثبيت الجلوتالالديهايد. قشر البيض هو من الأهمية بمكان لجنين الحيوانات oviparous ليس فقط من خلال العمل كغطاء وقائي ولكن أيضا توفير الاستقرار الميكانيكي، نفاذية للغاز والماء، واحتياطي الكالسيوم للجنين النامية. وتصنف قشرة بيض السلاحف في المياه العذبة على أنها "جامدة" علىأساس هيكلها، ونظرا لتوافرها قد تلقت اهتماما كبيرا من علماء الأحياء 1،2،3،4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
نحن بالتفصيل طرق بسيطة لسهولة فحص قشر البيض وأغشية قذيفة من السلاحف المطلية التي يمكن تطبيقها على أي أنواع قشر البيض جامدة. وتم تقييم منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة الناتجة عن ذلك وانخفاض القطع الأثرية المحتملة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

وعلى الرغم من أن الفحص المجهري للإلكترون (SEM) يستخدم على نطاق واسع لإجراء تحليل هيكلي فائق لمختلف العينات البيولوجية وغير البيولوجية، فإن الأساليب التي تنطوي عليها معالجة العينات البيولوجية المختلفة تنطوي على ممارسات فريدة من نوعها. جميع الممارسات التقليدية الموصوفة في المؤلفات لمعالجة العينات لا تزال تجد تطبيقات مفيدة، ولكن التغييرات الدقيقة في إعداد العينة يمكن أن تغير جودة الصورة، وكذلك، إدخال القطع الأثرية. وبالتالي، فإن استخدام تقنية إعداد عينة فريدة من نوعها محددة لنوع الأنسجة التي تم تحليلها مطلوب للحصول على صورة ذات نوعية جيدة مع دقة فائقة الهيكلية. تركز هذه الدراسة على توفير بروتوكولات إعداد العينات المثلى لتصوير الأجنة، والأصداف البيض الصلبة، والثقافات الفطرية باستخدام SEM. وقد أوصي تُوصِّل التحسينات التالية لتحقيق نتائج جيدة للعينات البيولوجية الحساسة الثلاث المختلفة التي تمت دراستها. استخدام المثبتات أكثر اعتدالا مثل 4٪ بارافورمالدهايد أو 3٪ الجلوتالالديهايد تليها الجفاف مع سلسلة الإيثانول إلزامي. الميسليوم الفطري على كتل أجار التي تم الحصول عليها من قبل الثقافات الشريحة تسفر عن سلامة أفضل فائقة الهيكلية بالمقارنة مع الثقافات التي اتخذت مباشرة من لوحات أجار. التجفيف الكيميائي للأجنة مع HMDS يوفر التجفيف دون إدخال القطع الأثرية التوتر السطحي مقارنة مع التجفيف نقطة حرجة. HMDS يمنع تكسير الناجمة عن انكماش كما عينات أقل هشاشة أثناء التجفيف. ومع ذلك، للثقافة الفطرية، التجفيف نقطة حرجة يوفر جودة صورة مقبولة بالمقارنة مع التجفيف الكيميائي. يمكن تصوير قشر البيض مع عدم وجود خطوات إعداد خاصة باستثناء الغسيل الدقيق وتجفيف الهواء قبل التركيب. وتم توحيد منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة المقبولة التي تم الحصول عليها مع كل تجربة.

ويبين الشكل 1 التحليل المجهري للإلكترون للسلحفاة المطلية (Chrysemyspicta) الأجنة. تم استخدام بيض السلاحف المطلية التي تم جمعها واحتضانها على وسط الفراش، التي شنت على كعب الألومنيوم بعد التجفيف الكيميائي لتصوير SEM (الشكل1A-E). تظهر الرؤية الجانبية للجن...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

لدينا بروتوكولات إعداد عينة موحدة لتصوير أجنت السلاحف المطلية، قشر البيض الجامدة والثقافات الفطرية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح. تستخدم هذه الطرق الشاملة تعديلات دقيقة على بروتوكولات معروفة لمعالجة ثلاثة أنسجة حساسة تسمح بالتمايز بين الهياكل الأصلية وتجهيز القطع الأثرية. (إنّها ستُظهر الإجراء معي ستكون (جيسيكا غيبونز، طالبة دراسات عليا من مختبريقبل جمع بيض السلاحف من موقع حقل خلال موسم التعشيش، قم بعمل أربعة إلى ستة ثقوب 0.25 سنتيمتر على طول جانبي الصناديق البلاستيكية وعلى أغطيةها للسماح بالتهيّم. قبل ملء الصناديق بمزيج رطب من الفرميكوليت والطحيات الخث الفراش في نسبة واحد إلى واحد. في موقع التعشيش ، قم بإزالة التربة بلطف للكشف عن البيض ومسح سطح كل بيضة سلحفاة مع صبغة اليود المخففة للحماية من التلوث الميكروبي أثناء الحضانة.ضع ما يصل إلى 8 إلى 9 بيضات في الصندوق في نفس التوجه والمحاذاة كما تم وضعها ، مع الحفاظ على براثن فردية منفصلة عن بعضها البعض. عندما يتم جمع جميع البويضات ، قم بدفن البويضات يدويًا في الفراش ووضع الصناديق ذات الغطاء داخل حاضنة 30 درجة مئوية لمدة 10 إلى 17 يومًا للحصول على المراحل الجنينية 12 و13 و 18 جنينًا على التوالي. أضف الماء المقطر إلى رطوبة جزئية من أغطية الفراش كل يومين لتجنب الجفاف، وللحفاظ على مستوى الرطوبة من أجل تطوير الجنين الطبيعي.في المرحلة المناسبة من التنمية، واستخدام مقص مدببة لجعل قطع على جانب واحد من قشر البيض الظهري وصفار غشاء معا، عموديا إلى محور طويل من البيض. بعد ذلك، قطع الجانب الآخر من البيضة على طول المحور القصير، واستخدام ملقط لقشر فتح قطعة مخرّضة مع جانب الجنين. قطع الجانب الجانبي الآخر من قشر البيض ووضع قطعة من قذيفة مخروق في برنامج تلفزيوني.باستخدام مجسم مجسم وملقط، قشر الجنين وصفار الغشاء من قشر البيض. استخدم ملقط ومقص صغير لإزالة الأغشية الجنينية الزائدة، واستخدام ملعقة جنين لنقل الجنين إلى طبق بيتري من برنامج تلفزيوني جديد. بعد غسل أي دم وصفار، ضع ما يصل إلى ثلاثة أجنة في بئر من لوحة 12-جيدا، تحتوي على 4٪ شبهفورمالدهيد في أربع درجات مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.عندما تظهر العينات بيضاء، استخدم إدراج البوليسترين مع قيعان شبكة البوليستر لشطف الأجنة مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS جديدة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، يجفف العينات في سلسلة الإيثانول الصاعدة لمدة ساعة واحدة لكل تركيز. بعد الغمر الإيثانول الثاني، جفف الأجنة في سلسلة من HMDS لتركيزات الإيثانول لمدة 20 دقيقة لكل غمر مع أطباق بيتري مغطاة جزئيا.ثم ضع الأجنة في حل HMDS نهائي بنسبة 100٪، مغطى بالكامل أو جزئيًا في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. التجفيف البطيء عن طريق زيادة تركيز HDMS على الإيثانول أمر مهم للكشف عن بنية سطحية ممتازة في الأجنة. في صباح اليوم التالي، استخدم مزدوج عصا الكربون موصل الشريط بعناية لتركيب العينات المجففة تماما على كعب دبوس الألومنيوم القياسية.عندما تم تركيب جميع العينات ، أدخل العينات في غرفة المعطف المكسوة لثني العينات مع طبقة رقيقة جدًا من الذهب لمدة 60 إلى 120 ثانية في 35 ملليمب. ثم ربط بإحكام مسامير مجموعة لتركيب كعب على لوحات صب المقابلة. استخدم أداة تبادل العينة لنقل حامل العينة إلى غرفة العينة في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي للتصوير.لإعداد قشر البيض لفحص المجهر الإلكتروني ، ضع قشر البيض في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة على الأقل بعد حصاد الجنين للقضاء على أي صفار أو تلوث الألبومين. بعد ذلك ، يجف الهواء قشر البيض النظيف على مناديل حساسة مضادة للثابت في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. تخزين قشر البيض المجفف في زجاجات عينة نظيفة، وصفت من قبل عدد ومرحلة الجنين.ثم، جبل، معطف sputter وصورة العينات قشر البيض كما أظهرت للتو للأجنة. لإنشاء الثقافات الفطرية الشريحة، واستخدام مشرط العقيمة لقطع نصف إلى ثلاثة أرباع كتل بوصة من البطاطا الصلبة dextrose أجار، ووضع كتل على الشرائح المجهر الزجاج الفردية. ضع المسواك العقيمة في الجزء السفلي من أطباق بيتري النظيفة لرفع الشرائح منها لخلق توتر سطحي بين الطبق والشريحة.ضع كل شريحة على المسواك في طبق بيتري. بعد ذلك ، استخدم حلقة معقمة لنقل الفطريات من العينة إلى كل من الجوانب الجانبية الأربعة لـ agar. أضف بضع قطرات من الماء المقطر العقيم إلى طبق بيتري حول الشريحة لضمان الرطوبة للفطريات المتنامية.ختم جزئيا لوحة مع فيلم البارافين ووضع لوحة في حاضنة درجة مئوية 30 لفترة الحضانة المناسبة للأنواع الفطرية. في نهاية الحضانة، وإزالة الشريحة من طبق بيتري واستخدام ملقط العقيمة لنقل كتلة أجار الالتزام بإحكام من الشريحة إلى حاوية من 3٪ glutaraldehyde لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، يجفف العينات في سلسلة الإيثانول الصاعدة لمدة 15 دقيقة لكل تركيز.بعد الغمر 90٪، معالجة العينات للجفاف النهائي مع اثنين من التغييرات 30 دقيقة في 100٪ الإيثانول لضمان تشبع كامل قبل وضع العينات المجففة في غرفة جهاز التجفيف نقطة الحرجة. ختم الغرفة وفتح الصمامات للسماح لثاني أكسيد الكربون السائل للتنفيس في والسماح للتنفيس الإيثانول حتى السائل ثاني أكسيد الكربون يملأ تماما الغرفة. بعد ذلك، ختم وتسخين الغرفة ببطء لتحقيق نقطة حرجة عندما يتجاوز ضغط الغرفة 1، 000 رطل من الضغط لكل بوصة مربعة، ودرجة الحرارة تتجاوز 31 درجة مئوية، ومساحة السائل والغاز من ثاني أكسيد الكربون في التوازن.ثم تصريف ببطء ثاني أكسيد الكربون من الغرفة والعينة كغاز، لتجنب أي آثار التوتر السطحي على العينة، وجبل، لوحة، وصورة العينات الفطرية كما هو موضح. يكشف منظر ميكروجراف إلكتروني ضوئي جانبي للمرحلة 12 مرسومة كيف يمتد بروز الفك العلوي إلى ما وراء الفك الفكي ويحد من الوسيللي حفرة أنف مميزة بشكل جيد. ويمكن أيضا ملاحظة خمسة أقواس البلعوم.في مرحلة 15 الجنين، somites شكلت حديثا مرئية في منطقة الذيل الخلفي من الجنين، وبراعم forelimb نقطة أكثر cortallyally من البطين. ويمكن أيضا تصور نمو واضح المعالم لقمة كارابيس على طول منطقة الجناح الداخلي بأكملها للجنين. في المرحلة 18 ، وقد تشكلت قصيرة إسقاط خطم ضعيف مع منقار أقل مقلوبة قليلا مع خطاف المحطة الطرفية التي تناسبها في الشق المركزي من المنقار العلوي.يظهر الفك العلوي مظهرًا مرقًا ، ويمكن رؤية سن بيضة صغيرة يتشكل على طرف الفك العلوي. التحليل Ultrastructural من قشر البيض Chrysemys picta وغشاء قذيفة عن طريق مسح المجهر الإلكترون، ويكشف عن طبقة قشر البيض كالكارينوس الخارجي، تعلق بقوة على غشاء قذيفة خيوطية الداخلية. ويتكون السطح الخارجي لقشرة البيض من وحدات مُعددنة مُميزة مصنوعة من عقيدات كروية كروية مجهّزة في مجموعات وبين وحدات القشرة المجاورة، مع تركيز منخفضات أو مسام دائرية صغيرة من مختلف الأحجام.لا يمكن تعميم المنهجيات المشتركة لجميع العينات البيولوجية لتحقيق جودة صورة لائقة باستخدام SEM. التعديلات الفريدة كما هو موضح ضرورية لأنواع محددة من الأنسجة. ويمكن أيضا استخدام طريقة التجفيف الكيميائي والجوي للعينات العضوية الأخرى، ويمكن استخدام تقنية زراعة الشرائح التي لديها اقتران في جميع الثقافات الميكروبية الناعمة والقوية.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

الأمثل تلطيخ سلبي: بروتوكول عالية الإنتاجية للدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

أساليب معالجة البيانات لتصوير السيزمية ثلاثية الأبعاد من البراكين تحت السطح: تطبيقات على البازلت الفيضانات تاريم

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

الحرارية المسح يتضمن (TSC) كأسلوب العامة لدراسة ومراقبة سلوك المرحلة البدنية موصلة الهلام

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

جمع واستخراج عينات من الهواء المهنية لتحليل الحمض النووي الفطرية

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

الفائق، بروتوكول Microscale لتحليل المعالجة البارامترات والصفات الغذائية في الذرة (ميس زيا ل.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

توزيع المياه Xylem في النباتات الخشبية تصور مع مجهر إلكترون المسح بالتبريد

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

طريقة إعداد عينة من المسح الضوئي وانتقال المجهر الإلكتروني لزوائد خنفساء الخشب

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...