Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego for nyttige diskussioner og kommentarer til manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge giver SUNY Oswego og National Science Foundation (NSF) små tilskud til PGL og JG.

Bemærk: malet skildpadde (Chrysemys picta) æg, der anvendes i denne undersøgelse blev indsamlet i løbet af nesting sæson af maj til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tilladelse fra New York State Department of Environmental Bevaring (DEC).
1. kemisk tørring metode til at behandle embryoner til SEM
<ol><li>Saml skildpadde æg fra marken steder i nesting sæsonen. Forbered inkubations kamrene på forhånd, lavet af plastikkasser med låg (L x b x H) ...

I vores undersøgelse, forskellige fikseringsmidler, dehydrering og tørring metoder blev testet til at forberede tre forskellige delikate biologiske prøver til SEM Imaging: embryoner, æggeskaller, og svampekulturer. SEM er almindeligt anvendt til overflade analyse, så fikserings penetration er mindre om, men det skal forstås, at dårligt faste interne strukturer vil forårsage indadgående svind eller/og kollapsede overflade strukturer. Forlænget fikserings tidspunkt bør også overvejes for større vævsprøver, d...

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturel analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensionelle profilering af prokaryoter, planter, og dyr. Den høje rumlige opløsning af en SEM gør det til en af de mest alsidige og kraftfulde teknikker til rådighed til undersøgelse af mikrostrukturelle egenskaber af prøver på nanometer til mikrometer skala. Udtørrede prøver er løst til kompositoriske og topografiske strukturer med intense detaljer, som giver grundlaget for at udvikle gyldige konklusioner om funktionelle relationer1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. ved tolkning af SEM-billeder af biologiske prøver er det en stor udfordring at skelne mellem indfødte strukturer og de artefakter, der oprettes under forarbejdningen. SEM drives normalt ved meget høje støvsugere for at undgå interferens fra gasmolekyler, der påvirker de primære, sekundære eller sensorer elektronstråler, der udsendes fra prøve10,11. Også, biologiske materialer er modtagelige for stråling skader på grund af deres dårlige eller ikke-ledende egenskaber. Det er vigtigt for de enheder indlæst i SEM at være helt tør og fri for organiske forurenende stoffer for at eliminere enhver mulig udgasning i en høj vakuum miljø10,11. Da biologiske prøver for det meste består af vand, er der behov for yderligere tilberednings teknikker for at sikre, at de indfødte strukturer bevares.
Den opnåede opløsning er baseret på optimering af tilberedningsmetoder, der er specifikke for modeltyper og anvendte instrumentelle parametre. Således, det er nødvendigt at undgå at bruge generelle forarbejdningstrin for alle vævstyper. Nogle biologiske prøver vil kræve mindre strenge behandling for at bevare deres struktur, mens mere tid og pleje kan være nødvendig for sarte typer af prøver for at undgå indførelse af tørring artefakter, såsom svind og kollaps. Prøveforberedelse er et kritisk skridt i SEM Imaging; resultaterne af morpreuometriske undersøgelser er bemærkelsesværdigt påvirket af prøvens forberedelsesprocedure12,13. Almindelige tilberednings trin for mange biologiske prøver er fiksering, udtørring og belægning med et metal som guld, platin eller Palladium for at omdanne deres overflader til at være ledende for SEM-analyse. Karakteren og kombinationen af de anvendte trin vil variere afhængigt af vævstype og de specifikke mål for undersøgelsen. Opladning ophobning, følsomhed over for vakuum og elektronstråle skader udgør problemer ved behandling af bløde sarte biologiske prøver, nødvendiggør yderligere behandling skridt til at bevare den oprindelige struktur af objektet. Ved hjælp af konventionelle metoder såsom osmium dinitrogentetraoxid fastsættelse, og dehydrering forårsage svind og sammenbrud af sarte væv14,15,16,17. Formålet med undersøgelsen er at etablere elegante metoder, der er afledt ved at kombinere ideer fra tidligere undersøgelser med modifikationer til at forberede og billede bløde sarte væv (f. eks, krybdyr embryoner, æggeskal af malede skildpadder, og svampekulturer).
Udvælgelse af en passende fastgørelsesmetode er det første vigtigste skridt for mikroskopisk analyse af biologiske prøver. Fastgørelse af vævet umiddelbart efter isolering fra en organisme er afgørende for at forhindre ændringer i deres morfologi på grund af nedbrydning. En effektiv fikserende bør opsige cellulære processer ved at gennemtrænge cellerne hurtigt og opretholde virkningen irreversibelt at stabilisere strukturen af prøven til at modstå både efterfølgende forarbejdningstrin og undersøgelse under SEM17 , 18. selv om flere kemiske og fysiske fikserings metoder er kendt, er kemisk fiksering mere almindeligt anvendt til biologiske prøver for at undgå cellulære ændringer som følge af autolyse, forrådnelse og tørre effekter. Der er talrige fiksativ kemiske formuleringer diskuteret i litteratur17,19,20,21,22,23, fikater, at arbejde ved denaturering og koagulerende biologiske makromolekyler, og dem, der fastsættes ved kovalent tværgående makromolekyler. Alkoholer anvendes som denatureringsmidler, der bevarer ultrastruktur meget dårligt og bruges mest til let mikroskopi og anbefales ikke til elektron mikroskopisk analyse. Tværbindende fikser som formaldehyd, glutaraldehyd og osmium tetroxid skaber intermolekylære og intramolekoleculære tværbindende mellem makromolekyler i vævene, hvilket giver fremragende bevaring af ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiske prøver er følsomme over for temperatur. Temperaturen i begyndelsen af fiksering anbefales at være 4 °C for at reducere den laterale mobilitet af membran proteiner, at bremse udbredelsen af intercellulære molekyler, og at bremse satsen for fiksering11. Den tid, der kræves til fastgørelse af væv, afhænger i høj grad af prøvens størrelse og den hastighed, hvormed fikserings formen diffuserer og reagerer med komponenterne i prøven. En overnatning fiksering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS ved 4 °c er den foretrukne metode til SEM analyse af enheder, der anvendes i dette studie for deres sekventielle penetrerende egenskaber, som tillader mindre delikate prøver, der skal behandles17 , 18 , 19 , 20 , 27. et trin efter fiksering med osmium dinitrogentetraoxid elimineres ikke kun på grund af dets toksiske karakter, men det konstateredes også, at der ikke var nogen ekstra fordel ved at forbedre billedkvaliteten for de prøver, der blev analyseret i dette studie.
Biologiske prøver indeholder væsker, der forstyrrer SEM-operationen; Derfor skal prøverne tørres, før de indsættes i SEM prøvekammeret. Når dehydrering er sikret, skal opløsningsmidlet fjernes fra vævet uden at skabe artefakter i prøverne på grund af overfladespændingen/tørring. Tre forskellige tørre metoder blev almindeligt anvendt under behandling af væv til SEM Imaging: lufttørring, kritisk punkt tørring, og frysetørring prøver28,29,30,31. Få undersøgelser rapporterer alle tre tørring metoder producerer identiske resultater med animalske vævsprøver28,29,30,31. En generel praksis, der anvendes til mindre prøver, er kemisk dehydrering ved stigende koncentrationsserier af alkohol og hexamethyldisilazan (HMDS), men større prøver tørres ved hjælp af et kritisk punkt tørring (CPD) instrument32. Under tørringsprocessen, betydelige kræfter dannet i små hulrum, der passerer gennem prøven ved en væske/gas grænseflade; Dette kan endda føre til et fuldstændigt sammenbrud af de hule strukturer33. Enhver deformation, der opstår på grund af behandlingen, kan derefter forveksles som en naturlig strukturel egenskab ved præparatet. Således bør det generaliserede fænomen til forarbejdning elimineres, og en unik tørring proces bør være standardiseret for hver type væv, især når sarte væv prøver analyseres.
I flere forsøg udført ved hjælp af forskellige kombinationer af alle de ovennævnte processer, vi standardiseret de metoder, der kan bruges til SEM analyse af tre sarte væv: krybdyr embryoner, æggeskaller af malede skildpadder, og svampe kulturer. Udviklingsmæssige biologer og morfologer beskriver normal og unormal morfogenese under embryo udvikling i repræsentative hvirveldyr. Undersøgelser af gensignalerings veje afhænger af den morfologiske beskrivelse af nye strukturer. For at undgå pludselige ændringer i hvirveldyr embryo struktur under SEM analyse, anbefaler vi kemisk tørring efter dehydrering. Kemisk tørring ved hjælp af HMDS er den relativt nyeste tørring metode og fordelene omfatter relativ hurtighed, brugervenlighed, tabte omkostninger, og den begrænsede ekspertise og udstyr behov9. CPD er en almindeligt anvendt tørring teknik ved hjælp af passaging CO2 på tværs af prøverne ved en bestemt temperatur og tryk. Vi identificerede, at HMDS er egnet til tørring af blødt sarte væv og gør det muligt at behandle større prøver sammenlignet med kritisk punkt tørring, hvilket forårsagede omfattende deformation af embryonale væv. Flere metoder er blevet brugt til at forberede prøver til SEM Imaging til at studere morfologiske egenskaber af svampe34. Svampe prøver er almindeligvis fastgjort i osmium dinitrogentetraoxid efterfulgt af ethanol dehydrering og kritisk punkt tørring, som kan give tilfredsstillende resultater, selv om de toksiske virkninger af osmium dinitrogentetraoxid6,7,35 og miste svampemidler, mens skiftende løsninger under behandlingen er udtalt ulemper. Prøve forberedelses teknikken ved hjælp af lufttørring uden fiksering er også blevet praktiseret36 men resulterer i skrumpet og kollapsede strukturer, og observation af sådanne prøver kan let misfortolkes, mens karakterisere arterne. Svampe hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en jævn tørring kan ikke opnås for at genoprette strukturen. På grund af denne effekt, frysetørring er almindeligt anvendt til tørring af bløde væv som svampemycelium. Frysetørring fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen af eventuelle salte eller sekretion vil skjule overflade detaljer, der vil blive identificeret kun på SEM visning fase. Vi koblede slide kultur metoden med glutaraldehyd fastgørelse og kritisk punkt tørring for at give strukturelle detaljer af intakt svampe hyfer og sporer. Selv om CPD tørring forårsagede svind i embryoner, det resulterede i velbevarede myceliale strukturer, når kombineret med glutaraldehyd fiksering. Æggeskallen er af største betydning for embryo af ovipar dyr ved ikke kun at fungere som en beskyttende beklædning, men også at give mekanisk stabilitet, permeabilitet til gas og vand, og en calcium reserve til det udviklende embryon. Ferskvands skildpadde æggeskaller klassificeres som "stive" baseret på deres struktur, og på grund af deres tilgængelighed har fået betydelig opmærksomhed fra biologer1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Vi detaljer enkle metoder til nem undersøgelse af æggeskal og Shell membraner af malet skildpadde, der kan anvendes til enhver stiv æggeskal arter. Forberedelses metoderne blev evalueret ud fra den resulterende billedkvalitet og reducerede potentielle artefakter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Selv om scanning elektronmikroskopi (SEM) er ved at blive udbredt til den ultra-strukturelle analyse af forskellige biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder, der er involveret i behandling af forskellige biologiske prøver involverer unikke praksis. Alle konventionelle praksisser beskrevet i litteraturen til behandling af prøver stadig finde nyttige applikationer, men subtile ændringer i prøven forberedelse kan ændre billedkvalitet, samt, indføre artefakter. Derfor, ved hjælp af en unik prøveforberedelse teknik specifikt for den type væv analyseret er nødvendig for at opnå en god kvalitet billede med ultrastrukturel opløsning. Fokus i denne undersøgelse er at give den optimale prøveforberedelse protokoller for billeddannelse embryoner, stive æggeskaller, og svampe kulturer ved hjælp af SEM. Følgende optimeringer blev anbefalet for at give gode resultater for de tre forskellige delikate biologiske prøver undersøgt. Brug af mildere fikser som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd efterfulgt af dehydrering med ethanol-serien er obligatorisk. Svampemycelium på agar blokke opnået ved slide kulturer giver en bedre ultrastrukturel integritet i forhold til kulturer taget direkte fra agar plader. Kemisk tørring af embryoner med HMDS giver tørring uden at indføre overflade spændings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørring. HMDS forebygger revner forårsaget af krympning, da prøverne er mindre skrøbelige under tørring. Men for svampe kulturen giver kritisk punkt tørring acceptabel billedkvalitet sammenlignet med kemisk tørring. Æggeskaller kan imældes uden særlige forberedelsestrin, bortset fra grundig vask og lufttørring før montering. Præparationsmetoder blev standardiseret baseret på acceptabel billedkvalitet opnået ved hvert forsøg.

Figur 1 Vis scanning elektron mikrografisk analyse af malet skildpadde (Chrysemys picta) embryoner. Malede skildpadde æg indsamlet og inkuberet på en strøelse medium, monteret på aluminium stubbe efter kemisk tørring blev brugt til SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning af et Stage 12-embryon viser de kraniofaciale strukturer; maxillær fremtrædende rækker ud over mandibulær og begrænser en velafmærket nasal pit medially...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Behandling af embryoer, æggeskaller og svampe kultur til scanning af elektronmikroskopi

Her præsenterer vi detaljerede forarbejdnings protokoller for billeddannelse delikate vævsprøver ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Tre forskellige forarbejdningsmetoder, nemlig disilazan disilazana (HMDS) kemisk tørring, enkel lufttørring, og kritisk punkt tørring er beskrevet for at forberede stive æggeskaller, embryoner på tidlige udviklingsmæssige stadier, og svampekulturer henholdsvis.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Vi har standardiserede prøveforberedelsesprotokoller til billeddannelse af malede skildpaddeembryoner, stive æggeskaller og svampekulturer ved hjælp af scanningselektromikroskopi. Disse omfattende metoder bruger subtile ændringer af kendte protokoller til at behandle tre sarte væv, der gør det muligt at skelne mellem originale strukturer og behandling af artefakter. Demonstration af proceduren med mig vil være Jessica Gibbons, en kandidat studerende fra mit laboratorium.Før indsamling skildpadde æg fra et felt site i nesting sæson, gøre fire til seks 0,25 centimeter huller langs siderne af plastkasser og på deres låg til at tillade befrugtning. Før påfyldning kasserne med en fugtig blanding af vermiculit og tørv mos strøelse blanding på en en til en ratio. Fjern forsigtigt jorden på redepladsen for at afdække æggene og tørre overfladen af hvert skildpaddeæg med en fortyndet jodinktur for at beskytte mod mikrobiel kontaminering under inkubation.Placer højst otte til ni æg pr boks i samme retning og tilpasning, som de blev lagt, holde individuelle koblinger adskilt fra hinanden. Når alle æggene er indsamlet, manuelt begrave æggene halvdelen i strøelse og placere låg kasser inde i en 30 grader Celsius inkubator i 10 til 17 dage for at opnå embryonale faser 12, 13 og 18 embryoner hhv. Tilsæt destilleret vand til delvist våd strøelse medium hver anden dag for at undgå dehydrering, og for at opretholde fugten niveau for normal embryo udvikling.På det rette udviklingstrin skal du bruge spidse sakse til at foretage et snit på den ene side af dorsaleæggeskallen og æggeblommemembranen sammen, lodret til æggets lange akse. Dernæst skæres den anden side af ægget langs den korte akse, og brug krafterne til at skrælle det punkterede stykke med embryonet side op. Skær den anden laterale side af æggeskallen og læg det punkterede stykke skal i PBS.Brug et stereomikroskop og saftæt, skræl embryo og æggeblomme membran fra æggeskallen. Brug snævler og mikro saks til at fjerne de ekstra embryonale membraner, og bruge en embryoske til at overføre fosteret i en petriskål af frisk PBS. Efter vask væk blod og æggeblomme, sted op til tre embryoner pr brønd af en 12-brønd plade, der indeholder 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius i to til tre dage.Når prøverne forekommer hvide, anvendes polystyrenindsatser med polyestermaskebund til at skylle embryonerne med tre fem minutters vask i frisk PBS pr. vask. Efter den sidste vask dehydreres prøverne i en stigende ethanolserie i en time pr. koncentration. Efter den anden ethanolnedsækning tørres embryonerne i en serie HMDS til ethanolkoncentrationer i 20 minutter pr. nedsænkning med petriskålene delvist dækket.Derefter placere embryoner i en endelig 100% HMDS løsning, helt eller delvist dækket i en røghætte natten over. Langsom tørring ved gradvist at øge koncentrationen af HDMS til ethanol er vigtigt for at afsløre en fremragende overfladestruktur i embryonerne. Den næste morgen, bruge dobbelt stick carbon ledende tape til omhyggeligt montere de helt tørrede prøver på en standard aluminium pin stub.Når alle prøverne er monteret, indføres prøverne i sputtercoaterkammeret for at belægge prøverne med en meget tynd film guld i 60 til 120 sekunder ved en 35 milliamp sputter. Fastgør derefter indstilletskruerne sikkert for at montere stubbene på de tilsvarende hældplader. Brug prøvebytteværktøjet til at overføre prøveholderen til prøvekammeret på scanningselelektromikroskopet til billedbehandling.For at forberede æggeskaller til scanning elektronmikroskopi skal æggeskallerne i destilleret vand i mindst en time efter embryohøsten for at fjerne æggeblomme eller albuminforurening. Dernæst lufttørre de rensede æggeskaller på sarte antistatiske klude i røghætten natten over. De tørrede æggeskaller opbevares i rene prøveflasker, mærket efter antal og embryostadiet.Derefter montere, sputter pels og billede æggeskal prøver som netop demonstreret for embryoner. For at etablere slide svampekulturer, bruge en steril skalpel til at skære halvdelen til tre kvart tomme blokke af fast kartoffel dextrose agar, og placere blokke på de enkelte glas mikroskop dias. Placer sterile tandstikkere på bunden af rene petriskåle til at hæve dias ud af dem for at skabe overfladespænding mellem pladen og diaset.Placer hver slide på tandstikkere i petriskålen. Brug derefter en steril løkke til at overføre svampe fra prøveinoculum til hver af de fire laterale sider af en agarblok. Tilsæt et par dråber sterilt destilleret vand til petriskålen omkring diaset for at sikre fugt til de voksende svampe.Delvist forsegle pladen med paraffin film og placere pladen i 30 grader Celsius inkubator for passende inkubationstid for svampearter. I slutningen af inkubationen skal du fjerne diaset fra petriskålen og bruge sterile kraftbefængdere til at overføre den tætklæbede agarblok fra diaset til en beholder med 3% glutaraldehyd for en overnight inkubation ved fire grader Celsius. Næste morgen dehydreres prøverne i en stigende ethanolserie i 15 minutter pr. koncentration.Efter 90% nedsænkning behandles prøverne til endelig dehydrering med to 30 minutters ændringer i 100%ethanol for at sikre en fuldstændig mætning, før de dehydrerede prøver anbringes i kammeret i det kritiske punktstørringsapparat. Forsegle kammeret og åbne ventilerne for at tillade flydende kuldioxid at udlufte og lade ethanol udluftning, indtil flydende kuldioxid helt fylder kammeret. Dernæst forsegle og langsomt varme kammeret for at opnå et kritisk punkt, når kammertrykket overstiger 1,000 pounds af tryk per kvadrattomme, temperaturen overstiger 31 grader Celsius, og væske og gas rum kuldioxid er i ligevægt.Derefter langsomt dræne kuldioxid fra kammeret og prøven som en gas, for at undgå eventuelle virkninger af overfladespænding på prøven, og montere, plade, og billede svampeprøver som påvist. En lateral scanning elektron mikrograf opfattelse af en fase 12 malet skildpadde embryo afslører, hvordan maxillary fremtrædende strækker sig ud over mandibulære og medialt begrænser et godt markeret nasal pit. Fem svældsbuer kan også observeres.I en fase 15 embryo, nydannede somitter er synlige på den bageste hale region af fosteret, og forelimb knopper punkt mere kortalt end ventrally. En veldefineret udvækst af en rygskjold højderyg kan også visualiseres langs hele interlimb flanke region af fosteret. På trin 18, en kort svagt fremskring snude har dannet med en lidt opadvendt nedre næb med en terminal krog, der passer ind i det centrale hak i det øverste næb.Overkæben udviser et hak udseende, og en lille æg tand kan ses danner på spidsen af overkæben. Ultrastrukturel analyse af Chrysemys picta æggeskal og shell membran ved scanning elektron mikroskopi, afslører en ydre calcarinus æggeskal lag, solidt fastgjort til den indre glødetråde membran. Æggeskallens ydre overflade består af veladskjålede mineraliserede skalenheder af kugleformede kugleknudler arrangeret i grupper og i mellem tilstødende skalenheder med en koncentration af små afrundede fordybninger eller porer i forskellige størrelser.Fælles metoder kan ikke generaliseres for alle biologiske prøver for at opnå en anstændig billedkvalitet ved hjælp af SEM. Unikke ændringer som påvist er afgørende for en bestemt vævstyper. Den kemiske og lufttørringsmetode kunne også anvendes til andre organiske prøver, og koblingsslidningskulturteknikken kan anvendes til alle bløde, robuste mikrobielle kulturer.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Surface Fornyelse: En avanceret Micrometeorological Metode til måling og bearbejdning Field-Scale Energy Flux Density data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodale Optisk mikroskopi Metoder Reveal Polyp vævsmorfologi og struktur i Caribien Reef Building Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Databehandling metoder for 3D seismiske billeddannelse af undergrunden vulkaner: programmer til Tarim oversvømmelse Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Termisk scanne Conductometry (TSC) som en generel metode for at studere og kontrollerende fase adfærd af ledende fysiske geler

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høj overførselshastighed, individuel protokol for analyse af behandling parametre og ernæringsmæssige kvaliteter i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionel (3D)-trykt skabelon for High Throughput zebrafisk Embryo opstilling

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Prøve forberedelse metode til scanning og transmission elektron mikroskop til tilhæng af træborebille

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...