Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

De auteurs willen graag Dr. Daniel BALDASSARRE, SUNY Oswego bedanken voor de nuttige discussies en opmerkingen over het manuscript. Deze studie werd gesteund door Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge verleent SUNY Oswego en National Science Foundation (NSF) kleine subsidies aan PGL en JG.

Opmerking: geschilderde schildpad (Chrysemys picta) eieren gebruikt in deze studie werden verzameld tijdens het broedseizoen van mei tot en met 2015-16 juni van Rice Creek Field Station, Oswego New York met toestemming verkregen van de New York staat ministerie van milieu Instandhouding (DEC).
1. chemische droogmethode voor het verwerken van embryo's voor SEM
<ol><li>Verzamel schildpadeieren van veld plaatsen tijdens het broedseizoen. Maak de incubatie kamers vooraf klaar, gemaakt v...

In onze studie werden verschillende fixatie middelen, uitdroging en droog methoden getest om drie verschillende delicate biologische monsters voor SEM-beeldvorming te bereiden: embryo's, eierschalen en schimmel culturen. SEM wordt vaak gebruikt voor oppervlakte analyse, dus fixatieve penetratie is minder van kracht, maar het moet duidelijk zijn dat slecht vaste interne structuren tot in-en inklapende Oppervlaktestructuren zullen leiden. Verlengde fixatietijd moet ook worden overwogen voor grotere weefselmonsters, waarbij...

Scanning elektronen microscoop (SEM) ultrastructurele analyse en intracellulaire Imaging supplement Lichtmicroscopie voor driedimensionale profilering van prokaryoten, planten en dieren. De hoge ruimtelijke resolutie van een SEM maakt het een van de meest veelzijdige en krachtige technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van microstructurele kenmerken van specimens op de nanometer tot micrometer schaal. Gedroogde specimens worden herleid tot samenstellings-en topografische structuren met intense Details, die de basis vormen voor het ontwikkelen van geldige conclusies over functionele relaties1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. bij het INTERPRETEREN van SEM-afbeeldingen van biologische specimens, is het een grote uitdaging om onderscheid te maken tussen inheemse structuren en de artefacten die tijdens de verwerking worden gemaakt. SEM wordt over het algemeen gebruikt bij zeer hoge stofzuigers om interferentie te voorkomen van gasmoleculen die de primaire, secundaire of backverstrooide elektronenstralen van het monster10,11aantasten. Ook zijn biologische materialen vatbaar voor stralings schade door hun slechte of niet-geleidende eigenschappen. Het is van essentieel belang dat de in het SEM geladen specimens volledig droog zijn en vrij zijn van organische verontreinigingen om eventuele Uitgassen in een hoge vacuüm omgeving van10,11te elimineren. Aangezien biologische specimens meestal uit water bestaan, zijn er aanvullende preparatieve technieken nodig om ervoor te zorgen dat de inheemse structuren behouden blijven.
De verkregen resolutie is gebaseerd op het optimaliseren van bereidingsmethoden specifiek voor specimen types en instrumentale parameters gebruikt. Dus, is het noodzakelijk om te voorkomen dat het gebruik van gegeneraliseerde verwerkingsstappen voor alle weefsel typen. Sommige biologische specimens vereisen minder strenge verwerking om hun structuur te behouden, terwijl er meer tijd en zorg nodig kan zijn voor delicate soorten monsters om de invoering van droog artefacten, zoals krimp en ineenstorting, te voorkomen. Monstervoorbereiding is een cruciale stap in SEM-beeldvorming; de bevindingen van Morfometrische studies zijn opmerkelijk beïnvloed door preparaat bereidings procedures12,13. Veelgebruikte voorbereidingsstappen voor veel biologische monsters zijn fixatie, uitdroging en coating met een metaal zoals goud, platina of Palladium om hun oppervlakken te converteren naar geleidende voor SEM-analyse. De aard en combinatie van de gebruikte stappen zal variëren afhankelijk van het type van het weefsel, en de specifieke doelstellingen van de studie. De opbouw van de lading, gevoeligheid voor vacuüm-en elektronenstraal schade vormen problemen bij het verwerken van zachte delicate biologische monsters, wat extra verwerkingsstappen vereist om de inheemse structuur van het object te behouden. Met behulp van conventionele methoden zoals osmium tetroxide Fixing, en uitdroging veroorzaken krimp en de ineenstorting van delicate weefsels14,15,16,17. Het doel van de studie is het opzetten van elegante methodologieën die zijn afgeleid door het combineren van ideeën uit eerdere studies met aanpassingen om zachte delicate weefsels voor te bereiden en te maken (bijv. reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden en schimmel culturen).
Selectie van een geschikte bevestigingsmethode is de eerste belangrijkste stap voor microscopische analyse van biologische specimens. Het is essentieel om de weefsels onmiddellijk na het isoleren van een organisme te fixeren om veranderingen in hun morfologie als gevolg van ontleding te voorkomen. Een effectieve fixatie moet cellulaire processen beëindigen door de cellen snel te doordringen en het effect onomkeerbaar te houden om de structuur van het monster te stabiliseren om zowel de volgende verwerkingsstappen te weerstaan als het onderzoek onder de SEM17 , 18. Hoewel verschillende chemische en fysische fixatie methoden bekend zijn, wordt chemische fixatie vaker gebruikt voor biologische specimens om cellulaire veranderingen als gevolg van autolyse, putrefactie en droog effecten te voorkomen. Er zijn talrijke fixatieve chemische formuleringen besproken in de literatuur17,19,20,21,22,23, fixeermiddelen die werken door denaturering en stolling van biologische macromoleculen, en die die repareren door covalent cross-linking macromoleculen. Alcoholen worden gebruikt als denaturerende fixeermiddelen die ultra structuur zeer slecht behouden en worden meestal gebruikt voor lichte microscopie en niet aanbevolen voor elektronen microscopische analyse. Kruislings verbindende Fixatieven zoals formaldehyde, glutaraldehyde en osmium tetroxide creëren intermoleculaire en intramoleculaire crosslinking tussen macromoleculen binnen de weefsels, wat een uitstekend behoud van ultra-structuren oplevert11 ,24,25,26. Biologische monsters zijn gevoelig voor temperatuur. De temperatuur aan het begin van de fixatie wordt aanbevolen om 4 °C te zijn om de laterale mobiliteit van membraan proteïnen te verminderen, om de diffusie van intercellulaire moleculen te vertragen en om de snelheid van fixatie te vertragen11. De tijd die nodig is voor de vaststelling van weefsels hangt grotendeels af van de grootte van het monster en de snelheid waarmee de fixatie diffitert en reageert met de componenten van het preparaat. Een overnachting fixatie in 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde in PBS bij 4 °C is de voorkeursmethode voor SEM-analyse van specimens die in deze studie worden gebruikt voor hun sequentiële penetratieve eigenschappen, waardoor kleinere delicate monsters kunnen worden verwerkt17 , 18 , 19 , 20 , 27. een post-fixatie stap met osmium tetroxide wordt niet alleen geëlimineerd vanwege zijn toxische aard, maar heeft ook tot gevolg dat er geen bijkomend voordeel wordt toegepast om de beeldkwaliteit te verbeteren voor de monsters die in deze studie worden geanalyseerd.
Biologische monsters bevatten vloeistoffen die interfereren met de SEM-werking; Vandaar dat de monsters moeten worden gedroogd voordat ze in de SEM-monsterkamer worden ingevoegd. Zodra uitdroging is verzekerd, moet het oplosmiddel uit het weefsel worden verwijderd zonder artefacten in de specimens te maken vanwege de oppervlaktespanning/droging. Drie verschillende droog methoden werden vaak gebruikt tijdens het verwerken van weefsels voor SEM-beeldvorming: luchtdroging, het drogen van kritische punten en vriesdrogen monsters28,29,30,31. Weinig studies rapporteren alle drie droog methoden die identieke resultaten produceren met dierlijk weefselmonsters28,29,30,31. Een algemene praktijk die voor kleinere specimens wordt gebruikt, zijn chemische uitdroging door oplopende concentratie Series alcohol en Hexamethyldisilazaan (HMD'S), maar grotere specimens worden gedroogd met behulp van een kritisch punt drogen (CPD) instrument32. Tijdens het droogproces worden aanzienlijke krachten gevormd in kleine holten die door een vloeistof/gasinterface door het preparaat worden doorgegeven; Dit kan zelfs leiden tot een volledige ineenstorting van de holle structuren33. Elke vervorming die optreedt als gevolg van de behandeling kan dan worden verward als een native structureel kenmerk van het preparaat. Zo moet het gegeneraliseerde fenomeen voor de verwerking worden geëlimineerd en moet een uniek droogproces worden gestandaardiseerd voor elk type weefsel, vooral wanneer delicate weefselmonsters worden geanalyseerd.
In verschillende proeven uitgevoerd met behulp van verschillende combinaties van alle bovengenoemde processen, we gestandaardiseerd de methoden die kunnen worden gebruikt voor SEM analyse van drie delicate weefsels: reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden, en schimmel culturen. Ontwikkelingsbiologen en morfologen beschrijven normale en abnormale morfogenese tijdens de ontwikkeling van embryo's bij representatieve gewervelde dieren. Onderzoeken naar gensignalerings trajecten hangen af van de morfologische beschrijving van nieuwe structuren. Om een abrupte verandering in de gewervelde embryo structuur te voorkomen tijdens SEM-analyse, raden we aan chemisch drogen na uitdroging. Chemisch drogen met HMDS is de relatief nieuwste droogmethode en de voordelen zijn relatieve snelheid, gebruiksgemak, verloren kosten en de beperkte expertise en uitrusting die nodig is9. CPD is een veelgebruikte droogtechniek met behulp van afdraaien co2 over de specimens bij een specifieke temperatuur en druk. We identificeerden dat HMDS geschikt is voor het drogen van zachte delicate weefsels en maakt het mogelijk grotere monsters te verwerken in vergelijking met kritische punt droging, wat een uitgebreide vervorming van embryonale weefsels veroorzaakte. Er zijn verschillende methoden gebruikt om monsters voor SEM-beeldvorming voor te bereiden om de morfologische kenmerken van schimmels34te bestuderen. Schimmel preparaten worden vaak vastgesteld in osmium tetroxide, gevolgd door ethanol uitdroging en kritische punt droging, wat bevredigende resultaten kan opleveren, hoewel de toxische effecten van osmium tetroxide6,7,35 en het verliezen van schimmel materialen terwijl het veranderen van oplossingen tijdens de verwerking zijn uitgesproken nadelen. De monster bereidingstechniek met behulp van lucht drogen zonder fixatie is ook beoefend36 maar resulteert in gekrompen en ingeklapte structuren, en observatie van dergelijke specimens kan gemakkelijk worden geïnterpreteerd terwijl het karakteriseren van de soort. Schimmel hypha verliest zijn integriteit in contact met vloeistoffen en een gelijkmatige droging kan niet worden bereikt om de structuur te herstellen. Als gevolg van dit effect, vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het drogen van zachte weefsels zoals schimmel mycelium. Vriesdrogen werkt goed voor schone materialen, maar de aanwezigheid van zouten of secretie zal het oppervlak detail dat alleen in de SEM-kijk fase zal worden geïdentificeerd, verhullen. We koppelden de Slide Culture Method met Glutaaraldehyde bevestiging en kritische punt droging om structurele details van intacte schimmel schimmeldraden en sporen te geven. Hoewel het drogen van CPD veroorzaakt krimp in embryo's, resulteerde het in goed bewaard gebleven myceliële structuren in combinatie met Glutaaraldehyde fixatie. De eierschaal is van primair belang voor het embryo van ovipareuze dieren door niet alleen als beschermende bekleding te fungeren, maar ook mechanische stabiliteit, permeabiliteit aan gas en water, en een calcium reserve voor het zich ontwikkelende embryo te bieden. Zoet waterschildpad eierschalen worden geclassificeerd als "rigide" op basis van hun structuur, en vanwege hun beschikbaarheid hebben aanzienlijke aandacht gekregen van biologen1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
We detail eenvoudige methoden voor eenvoudig onderzoek van de eierschaal en shell membranen van geschilderde schildpad die kan worden toegepast op elke stijve eierschaal soorten. Voorbereidings methoden werden geëvalueerd op basis van de resulterende beeldkwaliteit en verminderde potentiële artefacten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Hoewel Scanning elektronenmicroscopie (SEM) op grote schaal wordt gebruikt voor de ultra-structurele analyse van verschillende biologische en niet-biologische monsters, omvatten de methoden die betrokken zijn bij de verwerking van verschillende biologische monsters unieke praktijken. Alle conventionele praktijken beschreven in de literatuur voor het verwerken van monsters nog steeds nuttige toepassingen, maar subtiele veranderingen in de monstervoorbereiding kunnen de beeldkwaliteit veranderen, evenals, introduceren artefacten. Daarom is het gebruik van een unieke monster voorbereidings techniek specifiek voor het type weefsel geanalyseerd nodig om een beeld van goede kwaliteit te verkrijgen met een ultrastructurele resolutie. De focus van deze studie is het bieden van de optimale monster voorbereidings protocollen voorbeeld vormende embryo's, stijve eierschalen en schimmel culturen met SEM. De volgende optimalisaties werden aanbevolen om goede resultaten te opleveren voor de drie verschillende onderzochte delicate biologische monsters. Het gebruik van mildere Fixatieven zoals 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde gevolgd door uitdroging met ethanol serie is verplicht. Schimmel mycelium op agar-blokken verkregen door diaculturen levert een betere ultrastructurele integriteit op in vergelijking met culturen die rechtstreeks uit agar-platen worden genomen. Chemisch drogen van embryo's met HMDS zorgt voor droging zonder oppervlaktespanning artefacten te introduceren in vergelijking met kritische punt droging. HMDS voorkomt barsten veroorzaakt door krimp omdat monsters minder broos zijn tijdens het drogen. Voor de schimmel cultuur zorgt het drogen van kritische punten echter voor een acceptabele beeldkwaliteit in vergelijking met chemisch drogen. Eierschalen kunnen worden afgebeeld zonder speciale voorbereidingsstappen, behalve voor grondig wassen en drogen van de lucht voorafgaand aan de montage. Voorbereidings methodieken werden gestandaardiseerd op basis van aanvaardbare beeldkwaliteit verkregen bij elke proef.

Figuur 1 Toon scanning elektronen micrografische analyse van geschilderde schildpad (Chrysemys picta) embryo's. Geschilderde schildpadeieren verzameld en geïnineerd op een strooisel medium, gemonteerd op aluminiumfolie na chemisch drogen werden gebruikt voor SEM-beeldvorming (Figuur 1a-E). Een zijaanzicht van een fase 12 embryo toont de craniofaciale structuren; maxillaire prominentie strekt zich verder uit dan de mandibulaire en beper...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

We hebben gestandaardiseerde monsterpreparaatatieprotocollen voor beeldvorming geschilderde schildpadembryo's, stijve eierschalen en schimmelculturen met behulp van scanning elektronenmicroscopie. Deze uitgebreide methoden maken gebruik van subtiele wijzigingen in bekende protocollen om drie delicate weefsels te verwerken waardoor de differentiatie tussen de oorspronkelijke structuren en de verwerking van de artefacten. Het aantonen van de procedure met mij zal Jessica Gibbons, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.Voordat je schildpadeieren verzamelt van een veldplaats tijdens het broedseizoen, maak je vier tot zes gaten van 0,25 centimeter langs de zijkanten van plastic dozen en op hun deksels om beademing mogelijk te maken. Voor het vullen van de dozen met een vochtig mengsel van vermiculiet en veenmos beddengoed mengsel op een een-op-een verhouding. Verwijder op de broedplaats voorzichtig de grond om de eieren te ontdekken en veeg het oppervlak van elk schildpadei af met een verdunde jodiumtinct om te beschermen tegen microbiële besmetting tijdens incubatie.Plaats maximaal acht tot negen eieren per doos in dezelfde oriëntatie en uitlijning als ze werden gelegd, waardoor individuele koppelingen gescheiden van elkaar. Wanneer alle eieren zijn verzameld, begraaf de eieren handmatig de helft in het beddengoed en plaatst u de dekseldozen gedurende 10 tot 17 dagen in een couveuse van 30 graden Celsius om embryonale stadia respectievelijk 12, 13 en 18 embryo's te verkrijgen. Voeg gedestilleerd water om de andere dag gedeeltelijk nat om uitdroging om uitdroging te voorkomen en om het vochtgehalte voor een normale embryoontwikkeling te handhaven.Gebruik in het juiste ontwikkelingsstadium een puntige schaar om een snede op één kant van de dorsale eierschaal en dooiermembraan samen te maken, verticaal tot de lange as van het ei. Snijd vervolgens de andere kant van het ei langs de korte as en gebruik tangen om het uitgesneden stuk met de embryozijde naar boven te schillen. Snijd de andere zijdelingse kant van de eierschaal en plaats het uitgesneden stuk schelp in PBS.Pel met behulp van een stereomicroscoop en tangen het embryo en het dooiermembraan uit de eierschaal. Gebruik de tang en microschaar om de extra embryonale membranen te verwijderen en gebruik een embryolepel om het embryo over te brengen in een petrischaaltje met verse PBS. Na het wegwassen van bloed en dooier, plaats tot drie embryo's per put van een 12-put plaat, met 4% paraformaldehyde op vier graden Celsius gedurende twee tot drie dagen.Wanneer de monsters wit lijken, gebruik polystyreen inserts met polyester mesh bodems om de embryo's te spoelen met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt dehydrateren monsters in een opgaande ethanolserie gedurende een uur per concentratie. Na de tweede ethanolonderdompeling, droog de embryo's in een reeks van HMDS tot ethanol concentraties gedurende 20 minuten per onderdompeling met de petrischaaltjes gedeeltelijk bedekt.Plaats de embryo's vervolgens in een laatste 100%HMDS-oplossing, die 's nachts geheel of gedeeltelijk bedekt is met een rookkap. Langzaam drogen door de concentratie van HDMS geleidelijk te verhogen tot ethanol is belangrijk voor het onthullen van een uitstekende oppervlaktestructuur in de embryo's. De volgende ochtend, gebruik dubbele stok carbon geleidende tape om zorgvuldig monteren van de volledig gedroogde monsters op een standaard aluminium pin stomp.Wanneer alle monsters zijn gemonteerd, introduceren de monsters in de sputter coater kamer om de monsters te coaten met een zeer dunne film van goud voor 60 tot 120 seconden op een 35 milliamp sputter. Bevestig vervolgens de ingestelde schroeven stevig om de stompen op de bijbehorende gietplaten te monteren. Gebruik het gereedschap voor de uitwisseling van monsters om de monsterhouder over te brengen naar de monsterkamer van de scanning elektronenmicroscoop voor beeldvorming.Om eierschalen voor te bereiden op het scannen van elektronenmicroscopie, plaatst u de eierschalen ten minste één uur na de embryooogst in gedestilleerd water om een dooier of albuminebesmetting te elimineren. Vervolgens drogen de gereinigde eierschalen op delicate antistatische doekjes in de rookkap 's nachts. Bewaar de gedroogde eierschalen in schone flessen, gelabeld op nummer en embryostadium.Dan, mount, sputter vacht en beeld van de eierschaal exemplaren zoals net aangetoond voor de embryo's. Om dia schimmelculturen vast te stellen, gebruik een steriele scalpel te snijden half tot drie kwart inch blokken van vaste aardappel dextrose agar, en plaats de blokken op individuele glazen microscoop dia's. Plaats steriele tandenstokers op de bodem van schone petrischaaltjes voor het verhogen van dia's van hen om oppervlaktespanning tussen de plaat en de dia te creëren.Plaats elke dia op de tandenstokers in de petrischaal. Gebruik vervolgens een steriele lus om schimmels van het monster entmateriaal over te brengen naar elk van de vier zijdelingse zijden van een agarblok. Voeg een paar druppels steriel gedestilleerd water toe aan de petrischaal rond de glijbaan om vocht voor de groeiende schimmels te garanderen.Verzegel de plaat gedeeltelijk met paraffinefolie en plaats de plaat in de 30 graden Celsius incubator voor de juiste incubatietijd voor de schimmelsoorten. Verwijder aan het einde van de incubatie de glijbaan van de petrischaal en gebruik steriele tangen om het strak aangehangen agarblok van de glijbaan naar een container van 3% glutaraldehyde over te brengen voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend dehydrateren de monsters in een opgaande ethanol serie gedurende 15 minuten per concentratie.Na de 90%-onderdompeling verwerkt u de monsters voor definitieve uitdroging met twee veranderingen van 30 minuten in 100% ethanol om een volledige verzadiging te garanderen voordat de uitgedroogde monsters in de kamer van het kritieke puntdroogapparaat worden geplaatst. Sluit de kamer af en open de kleppen om vloeibare kooldioxide binnen te laten ontluchten en om de ethanol eruit te laten ontluchten totdat vloeibare kooldioxide de kamer volledig vult. Vervolgens verzegelen en langzaam verwarmen van de kamer om een kritiek punt te bereiken wanneer de kamerdruk meer dan 1.000 pond druk per vierkante inch, de temperatuur hoger is dan 31 graden Celsius, en de vloeistof en gas ruimte van kooldioxide is in evenwicht.Dan langzaam afvoer van de kooldioxide uit de kamer en het monster als een gas, om eventuele effecten van oppervlaktespanning op het monster te voorkomen, en monteren, plaat, en beeld de schimmelmonsters zoals aangetoond. Een laterale scanning elektronenmicrograaf weergave van een stadium 12 geschilderde schildpad embryo laat zien hoe de maxillaire bekendheid reikt dan de mandibulaire en mediaal beperkt een goed gemarkeerde neusput. Vijf faryngeale bogen kunnen ook worden waargenomen.In een stadium 15 embryo, nieuw gevormde somites zijn zichtbaar op het achterste staartgebied van het embryo, en de voorpoot knoppen punt meer cortally dan ventrally. Een goed gedefinieerde uitgroei van een carapace ridge kan ook worden gevisualiseerd langs de gehele interlimb flank regio van het embryo. In fase 18, een korte feebly projecterende snuit heeft gevormd met een iets omgekeerde onderste snavel met een terminale haak die past in de centrale inkeping van de bovenste snavel.De bovenkaak vertoont een ingekerfd uiterlijk, en een kleine ei tand kan worden gezien vormen op het puntje van de bovenkaak. Ultrastructurele analyse van de Chrysemys picta eierschaal en shell membraan door het scannen van elektronenmicroscopie, onthult een buitenste calcarinus eierschaal laag, stevig bevestigd aan de binnenste filamenteuze shell membraan. Het buitenoppervlak van de eierschaal bestaat uit goed onderscheiden gemineraliseerde schelpeenheden gemaakt van bolvormige bolvormige knobbeltjes die in groepen en tussen aangrenzende schelpeenheden zijn gerangschikt, met een concentratie van kleine afgeronde depressies of poriën van verschillende groottes.Gemeenschappelijke methoden kunnen niet worden gegeneraliseerd voor alle biologische specimens om een fatsoenlijke beeldkwaliteit te bereiken met behulp van SEM. Unieke veranderingen zoals aangetoond zijn essentieel voor een specifieke weefseltypes. De chemische en luchtdrogen methode kan ook worden gebruikt voor andere organische monsters, en de koppeling dia cultuur techniek kan worden gebruikt voor alle zachte, robuuste microbiële culturen.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Gegevens van de verwerkingsmethoden voor 3D seismische beeldvorming van ondergrond vulkanen: toepassingen aan het Tarim Flood Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermische Conductometry (TSC) scannen als een algemene methode voor het bestuderen van en het beheren van het gedrag van de fase van geleidende fysieke Gels

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

High-throughput, Microscale Protocol voor de analyse van verwerking Parameters en voedingswaarde in maïs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Monster voorbereiding methode van scannen en transmissie elektronenmicroscoop voor de aanhangsels van woodboring Kever

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...