Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
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Les auteurs tient à remercier le Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego pour les discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Cette étude a été appuyée par Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.

REMARQUE : Des œufs de tortue sépareuse (Chrysemys picta) utilisés dans cette étude ont été recueillis pendant la saison de nidance de mai à juin 2015-16 à partir de la station Rice Creek Field, Oswego New York, avec la permission du Département de l'environnement de l'État de New York. Conservation (DEC).
1. Méthode de séchage chimique pour traiter les embryons pour SEM
<ol><li>Recueillir les œufs de tortue s'ils proviennent des champs pendant la saison de nidification...

Dans notre étude, différents agents de fixation, méthodes de déshydratation et de séchage ont été testés pour préparer trois différents échantillons biologiques délicats pour l'imagerie SEM : embryons, coquilles d'œufs et cultures fongiques. SEM est couramment utilisé pour l'analyse de surface, de sorte que la pénétration fixative est moins préoccupante, mais il faut comprendre que les structures internes mal fixées causeront le rétrécissement vers l'intérieur ou / et les structures de surface effond...

L'analyse ultrastructurale de microscope électronique de balayage (SEM) et la microscopie intracellulaire de formation image complètent la lumière pour le profilage tridimensionnel des procaryotes, des usines, et des animaux. La haute résolution spatiale d'un SEM en fait l'une des techniques les plus polyvalentes et les plus puissantes disponibles pour l'examen des caractéristiques microstructurales des spécimens à l'échelle nanométrique à micromètre. Les spécimens desséchés sont résolus aux structures compositionnelles et topographiques avec le détail intense, qui fournit la base pour développer des conclusions valides au sujet des relations fonctionnelles1,2,3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Lors de l'interprétation des images SEM de spécimens biologiques, il est très difficile de faire la distinction entre les structures indigènes et les artefacts qui sont créés au cours du traitement. SEM est généralement exploité à des vides très élevés pour éviter toute interférence des molécules de gaz affectant les faisceaux d'électrons primaires, secondaires ou rétrodiffusés émis par l'échantillon10,11. En outre, les matériaux biologiques sont sensibles aux dommages causés par les radiations en raison de leurs propriétés pauvres ou non conductrices. Il est essentiel que les spécimens chargés dans le SEM soient complètement secs et exempts de tout contaminant organique afin d'éliminer tout dégazage possible dans un environnement à vide élevé10,11. Comme les spécimens biologiques sont principalement composés d'eau, d'autres techniques de préparation sont nécessaires pour s'assurer que les structures indigènes sont conservées.
La résolution obtenue est basée sur l'optimisation des méthodes de préparation spécifiques aux types de spécimens et aux paramètres instrumentaux utilisés. Ainsi, il est nécessaire d'éviter d'utiliser des étapes de traitement généralisées pour tous les types de tissus. Certains spécimens biologiques exigeront un traitement moins rigoureux pour préserver leur structure, tandis que plus de temps et de soins pourraient être nécessaires pour les types délicats d'échantillons afin d'éviter l'introduction d'artefacts de séchage, tels que le rétrécissement et l'effondrement. La préparation de l'échantillon est une étape critique dans l'imagerie SEM; les résultats des études morphométriques sont remarquablement influencés par les procédures de préparation des spécimens12,13. Les étapes de préparation courantes pour de nombreux échantillons biologiques sont la fixation, la déshydratation et le revêtement avec un métal comme l'or, le platine ou le palladium pour convertir leurs surfaces pour être conductrices pour l'analyse SEM. La nature et la combinaison des étapes utilisées varient selon le type de tissu et les objectifs spécifiques de l'étude. L'accumulation de charges, la sensibilité aux dommages causés par le vide et les faisceaux d'électrons posent des problèmes lors du traitement d'échantillons biologiques délicats, ce qui fait qu'il faut d'autres étapes de traitement pour conserver la structure indigène de l'objet. L'utilisation de méthodes conventionnelles telles que la fixation du tétroxide d'osmium, et la déshydratation causent le rétrécissement et l'effondrement des tissus délicats14,15,16,17. L'objectif de l'étude est d'établir des méthodologies élégantes dérivées en combinant des idées d'études antérieures avec des modifications pour préparer et imager les tissus délicats mous (p. ex. embryons de reptiles, coquille d'œuf de tortues peintes et cultures fongiques).
La sélection d'une méthode de fixation appropriée est la première étape la plus importante pour l'analyse microscopique des spécimens biologiques. La fixation des tissus immédiatement après l'isoler d'un organisme est essentielle pour empêcher l'altération de leur morphologie due à la décomposition. Un fixatif efficace devrait mettre fin aux processus cellulaires en permédiant les cellules rapidement et en maintenant l'effet de façon irréversible pour stabiliser la structure de l'échantillon pour résister à la fois aux étapes de traitement et à l'examen ultérieurs dans le cadre du SEM17 , 18. Bien que plusieurs méthodes chimiques et physiques de fixation soient connues, la fixation chimique est plus couramment utilisée pour les spécimens biologiques afin d'éviter tout changement cellulaire dû à l'autolyse, à la putréfaction et aux effets de séchage. Il existe de nombreuses formulations chimiques fixatives discutées dans la littérature17,19,20,21,22,23, fixatives qui fonctionnent par dénaturation et coagulant les macromolécules biologiques, et celles qui se fixent par macromolécules covalentes de liaison croisée. Les alcools sont utilisés comme fixatifs dénaturants qui préservent l'ultrastructure très mal et sont utilisés principalement pour la microscopie légère et non recommandés pour l'analyse microscopique des électrons. Les fixatifs croisés comme le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et le tétroxide d'osmium créent des liaisons intermoléculaires et intramoléculaires entre les macromolécules dans les tissus, offrant une excellente préservation des ultra-structures11 ,24,25,26. Les échantillons biologiques sont sensibles à la température. Il est recommandé de réduire la mobilité latérale des protéines membranaires, de ralentir la diffusion des molécules intercellulaires et de ralentir le taux de fixation11. Le temps nécessaire à la fixation des tissus dépend en grande partie de la taille de l'échantillon et de la vitesse à laquelle le fixatif se diffuse et réagit avec les composants de l'échantillon. Une fixation de nuit dans 4% de paraformaldéhyde ou 3% de glutaraldéhyde dans pbS à 4 oC est la méthode préférée pour l'analyse SEM des spécimens utilisés dans cette étude pour leurs propriétés pénétrantes séquentielles, qui permettent de traiter de plus petits échantillons délicats17 , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 27. Une étape post-fixation avec le tétroxide d'osmium est éliminée non seulement en raison de sa nature toxique, mais aussi en raison de sa nature toxique, mais aussi trouvé à mettre en œuvre aucun avantage supplémentaire pour améliorer la qualité de l'image pour les échantillons analysés dans cette étude.
Les échantillons biologiques contiennent des fluides qui interfèrent avec le fonctionnement du SEM; par conséquent, les échantillons doivent être séchés avant de l'insérer dans la chambre d'échantillon SEM. Une fois la déshydratation assurée, le solvant doit être retiré du tissu sans créer d'artefacts dans les spécimens en raison de la tension de surface/séchage. Trois méthodes de séchage différentes ont été couramment utilisées lors du traitement des tissus pour l'imagerie SEM: séchage à l'air, séchage point critique, et le gel des échantillons de séchage28,29,30,31. Peu d'études rapportent que les trois méthodes de séchage produisent des résultats identiques avec des échantillons de tissus animaux28,29,30,31. Une pratique générale utilisée pour les petits spécimens est la déshydratation chimique par la série de concentration ascendante de l'alcool et hexamethyldisilazane (HMDS), mais les spécimens plus grands sont séchés à l'aide d'un point critique de séchage (CPD) instrument32. Pendant le processus de séchage, des forces considérables se sont formées dans de petites cavités qui sont passées à travers le spécimen par une interface liquide/gaz; cela peut même conduire à un effondrement complet des structures creuses33. Toute déformation due au traitement pourrait alors être confondue comme une caractéristique structurale indigène du spécimen. Ainsi, le phénomène généralisé pour le traitement devrait être éliminé et un processus de séchage unique devrait être normalisé pour chaque type de tissu particulièrement quand les spécimens délicats de tissu sont analysés.
Dans plusieurs essais menés à l'aide de diverses combinaisons de tous les processus mentionnés ci-dessus, nous avons normalisé les méthodes qui peuvent être utilisées pour l'analyse SEM de trois tissus délicats: embryons de reptiles, coquilles d'œufs de tortues peintes, et les cultures fongiques. Les biologistes et les morphologues développementaux décrivent la morphogénèse normale et anormale pendant le développement d'embryons chez les animaux vertébrés représentatifs. Les recherches sur les voies de signalisation génique dépendent de la description morphologique de structures nouvelles. Pour éviter tout changement brusque dans la structure de l'embryon vertébré au cours de l'analyse SEM, nous recommandons le séchage chimique après déshydratation. Le séchage chimique à l'aide du SDM est la méthode de séchage relativement récente et les avantages comprennent une rapidité relative, une facilité d'utilisation, une perte de coûts et l'expertise et l'équipement limités nécessaires9. La DPC est une technique de séchage couramment utilisée à l'aide de colsaging CO2 à travers les spécimens à une température et une pression spécifiques. Nous avons identifié que le HMDS convient au séchage des tissus mous et délicats et permet de traiter de plus grands échantillons par rapport au séchage à points critiques, ce qui a causé une déformation importante des tissus embryonnaires. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour préparer des échantillons pour l'imagerie SEM afin d'étudier les caractéristiques morphologiques des champignons34. Les spécimens fongiques sont généralement fixés dans le tétroxide d'osmium suivi de la déshydratation de l'éthanol et du séchage critique de point, qui peut fournir des résultats satisfaisants, bien que les effets toxiques du tétroxide d'osmium6,7,35 et la perte de matériaux fongiques tout en changeant des solutions pendant le traitement sont des inconvénients prononcés. La technique de préparation des échantillons utilisant le séchage à l'air sans fixation a également été pratiquée36, mais les résultats en structures rétrécies et effondrées, et l'observation de ces spécimens peut facilement être mal interprétée tout en caractérisant l'espèce. L'hypha fongique perd son intégrité au contact des liquides et un séchage uniforme peut ne pas être réalisé pour restaurer la structure. En raison de cet effet, le lyophilisation est couramment utilisé pour sécher les tissus mous comme le mycélium fongique. Le séchage par congélation fonctionne bien pour les matériaux propres, mais la présence de sels ou de sécrétion obscurcira les détails de surface qui ne seront identifiés qu'à l'étape d'observation de la SEM. Nous avons couplé la méthode de culture de diapositive avec la fixation de glutaraldéhyde et le séchage critique de point pour produire des détails structurels des hyphes et des spores fongiques intacts. Bien que le séchage de CPD ait causé le rétrécissement dans des embryons, il a eu comme conséquence les structures mycéliales bien préservées une fois couplées avec la fixation de glutaraldéhyde. La coquille d'œuf est d'une importance primordiale pour l'embryon d'animaux ovipares en agissant non seulement comme une couverture protectrice, mais aussi en fournissant une stabilité mécanique, la perméabilité au gaz et à l'eau, et une réserve de calcium pour l'embryon en développement. Les coquilles d'œufs de tortues d'eau douce sont classées comme « rigides » en fonction de leur structure, et en raison de leur disponibilité ont reçu une attention significative de la part des biologistes1,2,3,4 , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38.
Nous détaillons des méthodes simples pour l'examen facile des membranes de coquille d'oeuf et de coquille de la tortue peinte qui peuvent être appliquées à n'importe quelle espèce rigide de coquille d'oeuf. Les méthodologies de préparation ont été évaluées en fonction de la qualité de l'image résultante et de la réduction des artefacts potentiels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Bien que la microscopie électronique à balayage (SEM) soit largement utilisée pour l'analyse ultra-structurale de divers échantillons biologiques et non biologiques, les méthodes impliquées dans le traitement de différents échantillons biologiques impliquent des pratiques uniques. Toutes les pratiques conventionnelles décrites dans la littérature pour le traitement des échantillons trouvent encore des applications utiles, mais des changements subtils dans la préparation de l'échantillon peuvent modifier la qualité de l'image, ainsi que, introduire des artefacts. Par conséquent, l'utilisation d'une technique unique de préparation d'échantillons spécifique au type de tissu analysé est nécessaire pour obtenir une image de bonne qualité avec une résolution ultrastructurale. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles optimaux de préparation de l'échantillon pour l'imagerie des embryons, des coquilles d'œufs rigides et des cultures fongiques à l'aide de SEM. Les optimisations suivantes ont été recommandées pour donner de bons résultats pour les trois différents échantillons biologiques délicats étudiés. L'utilisation de fixatifs plus doux comme le paraformaldéhyde de 4 % ou le glutaraldéhyde de 3 % suivi de la déshydratation avec la série d'éthanol est obligatoire. Le mycélium fongique sur les blocs d'agar obtenus par les cultures de diapositives donne une meilleure intégrité ultrastructurale par rapport aux cultures prises directement à partir de plaques d'agar. Le séchage chimique des embryons avec HMDS permet le séchage sans introduire d'artefacts de tension de surface par rapport au séchage à points critiques. Le SMDM empêche la fissuration causée par le rétrécissement, car les échantillons sont moins cassants pendant le séchage. Cependant, pour la culture fongique, le séchage par point critique offre une qualité d'image acceptable par rapport au séchage chimique. Les coquilles d'œufs peuvent être représentées sans étapes de préparation spéciales, sauf pour un lavage complet et un séchage à l'air avant le montage. Les méthodes de préparation ont été normalisées en fonction de la qualité d'image acceptable obtenue à chaque essai.

La figure 1 montre l'analyse micrographique électronique de balayage des embryons peints de tortue (Chrysemyspicta). Des œufs de tortue peints recueillis et incubés sur un support de literie, montés sur des talons d'aluminium à la suite d'un séchage chimique, ont été utilisés pour l'imagerie SEM (figure1A-E). Une vue latérale d'un embryon de stade 12 montre les structures craniofacial ; la proéminence maxillaire s'étend au-...

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Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Traitement de l'embryon, de la coquille d'œuf et de la culture fongique pour la microscopie électronique à balayage

Ici, nous présentons des protocoles détaillés de traitement pour l'imagerie des échantillons de tissus délicats à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Trois méthodes de traitement différentes, à savoir, le séchage chimique du disilazana hexaméthylique (HMDS), le séchage simple à l'air et le séchage à points critiques sont décrits pour la préparation de coquilles d'œufs rigides, d'embryons à un stade de développement précoce et de cultures fongiques respectivement.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Nous avons des protocoles normalisés de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons de tortues peintes, de coquilles d’œufs rigides et de cultures fongiques à l’aide de microscopie électronique à balayage. Ces méthodes complètes utilisent des modifications subtiles aux protocoles connus pour traiter trois tissus délicats permettant la différenciation entre les structures originales et le traitement des artefacts. Jessica Gibbons, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.Avant de recueillir les œufs de tortues sur un site de champ pendant la saison de nidification, faire de quatre à six trous de 0,25 centimètre le long des côtés des boîtes en plastique et sur leurs couvercles pour permettre l’aération. Avant de remplir les boîtes d’un mélange humide de vermiculite et de mélange de literie de mousse de tourbe à un rapport un pour un. Au site de nidification, retirer délicatement le sol pour découvrir les œufs et essuyer la surface de chaque œuf de tortue avec une teinture diluée d’iode pour se protéger contre la contamination microbienne pendant l’incubation.Placez un maximum de huit à neuf œufs par boîte dans la même orientation et l’alignement qu’ils ont été pondus, en gardant les couvées individuelles séparées les unes des autres. Lorsque tous les œufs ont été recueillis, enterrer manuellement les œufs à moitié dans la literie et placer les boîtes lidded à l’intérieur d’un incubateur de 30 degrés Celsius pendant 10 à 17 jours pour obtenir des stades embryonnaires 12, 13 et 18 embryons respectivement. Ajouter de l’eau distillée pour mouiller partiellement le milieu de literie tous les deux jours afin d’éviter la déshydratation et pour maintenir le niveau d’humidité pour le développement normal de l’embryon.Au stade approprié du développement, utiliser des ciseaux pointus pour faire une coupe sur un côté de la coquille d’œuf dorsale et la membrane jaune ensemble, verticale à l’axe long de l’œuf. Ensuite, couper l’autre côté de l’œuf le long de l’axe court, et utiliser des forceps pour peler la pièce excisée avec le côté embryon vers le haut. Couper l’autre côté latéral de la coquille d’œuf et placer le morceau de coquille excisée dans PBS.À l’aide d’un stéréomicroscope et de forceps, peler l’embryon et la membrane jaune de la coquille d’œuf. Utilisez les forceps et les micro ciseaux pour enlever les membranes embryonnaires supplémentaires, et utilisez une cuillère embryonnaire pour transférer l’embryon dans une boîte de Pétri de PBS frais. Après avoir lavé le sang et le jaune, placer jusqu’à trois embryons par puits d’une plaque de 12 puits, contenant 4% de paraformaldéhyde à quatre degrés Celsius pendant deux à trois jours.Lorsque les échantillons semblent blancs, utilisez des inserts en polystyrène avec des fonds en maille de polyester pour rincer les embryons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant une heure par concentration. Après la deuxième immersion d’éthanol, séchez les embryons dans une série de concentrations de SMDH à des concentrations d’éthanol pendant 20 minutes par immersion avec les boîtes de Pétri partiellement couvertes.Placez ensuite les embryons dans une solution 100% HMDS finale, complètement ou partiellement recouverte d’une hotte de fumée pendant la nuit. Un séchage lent en augmentant progressivement la concentration de HDMS à l’éthanol est important pour révéler une excellente structure de surface chez les embryons. Le lendemain matin, utilisez du ruban conductrice au carbone à double bâton pour monter soigneusement les échantillons complètement séchés sur un talon d’épingle en aluminium standard.Lorsque tous les échantillons ont été montés, introduisez les échantillons dans la chambre du revêtement de pulvérisateur pour enrober les spécimens d’une très mince pellicule d’or pendant 60 à 120 secondes à un pulvérisateur de 35 milliamp. Attachez ensuite solidement les vis réglées pour monter les talons sur les plaques de coulée correspondantes. Utilisez l’outil d’échange d’échantillons pour transférer le support de l’échantillon dans la chambre d’échantillon du microscope électronique à balayage pour l’imagerie.Pour préparer les coquilles d’œufs à la numérisation de la microscopie électronique, placez les coquilles d’œufs dans de l’eau distillée pendant au moins une heure après la récolte de l’embryon afin d’éliminer toute contamination par le jaune ou l’albumine. Ensuite, séchez à l’air les coquilles d’œufs nettoyées sur des lingettes antistatiques délicates dans le capot de fumée pendant la nuit. Conserver les coquilles d’œufs séchées dans des bouteilles propres, étiquetées par nombre et stade embryonnaire.Puis, monter, pulvériser le pelage et l’image des spécimens coquille d’œuf comme il suffit de le démontrer pour les embryons. Pour établir des cultures fongiques de glissière, utilisez un scalpel stérile pour couper des blocs de moitié à trois quarts de pouce de l’agar solide de dextrose de pomme de terre, et placez les blocs sur les glissières individuelles de microscope en verre. Placez des cure-dents stériles sur le fond des boîtes de Pétri propres pour soulever les toboggans hors d’eux pour créer une tension de surface entre l’assiette et la lame.Placer chaque toboggan sur les cure-dents dans la boîte de Pétri. Ensuite, utilisez une boucle stérile pour transférer les champignons de l’inoculum du spécimen à chacun des quatre côtés latériaux d’un bloc d’agar. Ajouter quelques gouttes d’eau distillée stérile à la boîte de Pétri autour de la lame pour assurer l’humidité des champignons en croissance.Sceller partiellement la plaque avec du film de paraffine et placer la plaque dans l’incubateur de 30 degrés Celsius pour la période d’incubation appropriée pour les espèces fongiques. À la fin de l’incubation, retirez la lame de la boîte de Pétri et utilisez des forceps stériles pour transférer le bloc d’agar étroitement adhérent de la glissière à un contenant de 3 % de glutaraldehyde pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant 15 minutes par concentration.Après l’immersion de 90 %, traiter les échantillons pour la déshydratation finale avec deux changements de 30 minutes dans 100 % d’éthanol afin d’assurer une saturation complète avant de placer les échantillons déshydratés dans la chambre de l’appareil critique de séchage des points. Sceller la chambre et ouvrir les vannes pour permettre au dioxyde de carbone liquide de s’évacuer et de laisser l’éthanol s’évacuer jusqu’à ce que le dioxyde de carbone liquide remplisse complètement la chambre. Ensuite, scellez et chauffez lentement la chambre pour atteindre un point critique quand la pression de la chambre dépasse 1000 livres de pression par pouce carré, la température dépasse 31 degrés Celsius, et l’espace liquide et gazeux de dioxyde de carbone est en équilibre.Puis drainez lentement le dioxyde de carbone de la chambre et de l’échantillon sous forme de gaz, afin d’éviter tout effet de tension de surface sur l’échantillon, et montez, plaquez et imagez les spécimens fongiques comme démontré. Une vue latérale de micrographe électronique de balayage d’un embryon peint de tortue de stade 12 indique comment la proéminence maxillaire s’étend au-delà du mandibulaire et limite médilement une fosse nasale bien marquée. Cinq arches pharyngéales peuvent également être observées.Dans un embryon de stade 15, les somites nouvellement formés sont visibles à la région postérieure de la queue de l’embryon, et les bourgeons du membre antérieur pointent plus cortally que ventrally. Une excroissance bien définie d’une crête de carapace peut également être visualisée le long de toute la région du flanc interlimb de l’embryon. À l’étape 18, un museau à faible projet s’est formé avec un bec inférieur légèrement renversé avec un crochet terminal qui s’insère dans l’encoche centrale du bec supérieur.La mâchoire supérieure présente un aspect cranté, et une petite dent d’œuf peut être vu se former à la pointe de la mâchoire supérieure. L’analyse ultrastructurale de la coquille d’œuf chrysemys picta et de la membrane de la coquille en scannant la microscopie électronique, révèle une couche externe de coquille d’œuf calcarinus, fermement attachée à la membrane intérieure de la coquille filamenteuse. La surface extérieure de la coquille d’œuf se compose d’unités de coquille minéralisées bien distinguées faites de nodules sphériques globulaires disposés en groupes et entre les unités de coquille adjacentes, avec une concentration de petites dépressions arrondies ou de pores de différentes tailles.Les méthodologies communes ne peuvent pas être généralisées pour que tous les spécimens biologiques atteignent une qualité d’image décente en utilisant sem. Des altérations uniques telles que démontrées sont essentielles pour un type spécifique de tissu. La méthode de séchage chimique et d’air pourrait également être utilisée pour d’autres échantillons organiques, et la technique de culture des toboggans couplage pourrait être utilisée pour toutes les cultures microbiennes douces et robustes.

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