Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
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Die Autoren danken Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Studie wurde von Rice Creek Associate Grants, Oswego, unterstützt; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.

HINWEIS: Bemalte Schildkröten -Chrysemys picta) Eier, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden während der Brutzeit von Mai bis Juni 2015-16 von der Rice Creek Field Station, Oswego New York mit Genehmigung des New York State Department of Environmental gesammelt Konservierung (DEC).
1. Chemische Trocknungsmethode zur Verarbeitung von Embryonen für SEM
<ol><li>Sammeln Sie Schildkröteneier von Feldstandorten während der Brutzeit. Bereiten Sie die Inkubationskammern im Vorau...

In unserer Studie wurden verschiedene Fixierungsmittel, Dehydrierungs- und Trocknungsmethoden getestet, um drei verschiedene empfindliche biologische Proben für die SEM-Bildgebung vorzubereiten: Embryonen, Eierschalen und Pilzkulturen. SEM wird häufig für die Oberflächenanalyse verwendet, so dass die fixative Penetration weniger besorgniserregend ist, aber es muss verstanden werden, dass schlecht fixierte interne Strukturen nach innen schrumpfende oder/und kollabierte Oberflächenstrukturen verursachen. Erweiterte Fi...

Rasterelektronenmikroskop (SEM) Ultrastrukturanalyse und intrazelluläre Bildgebung ergänzen die Lichtmikroskopie zur dreidimensionalen Profilierung von Prokaryoten, Pflanzen und Tieren. Die hohe räumliche Auflösung eines SEM macht es zu einer der vielseitigsten und leistungsstärksten Techniken, die für die Untersuchung mikrostruktureller Eigenschaften von Proben im Nanometer-Mikrometer-Skala zur Verfügung stehen. Ausgetrocknete Exemplare werden zu kompositorischen und topographischen Strukturen mit intensiven Details aufgelöst, was die Grundlage für die Entwicklung gültiger Schlussfolgerungen über funktionelle Beziehungen1,2,3 bildet. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.Bei der Interpretation von SEM-Bildern biologischer Proben ist es eine große Herausforderung, zwischen einheimischen Strukturen und den Artefakten zu unterscheiden, die während der Verarbeitung entstehen. SEM wird in der Regel mit sehr hohen Vakuums betrieben, um Interferenzen durch Gasmoleküle zu vermeiden, die die primären, sekundären oder zurückgestreuten Elektronenstrahlen der Probe10,11beeinflussen. Außerdem sind biologische Materialien aufgrund ihrer schlechten oder nicht leitenden Eigenschaften anfällig für Strahlungsschäden. Es ist wichtig, dass die in das SEM geladenen Proben vollständig trocken und frei von organischen Verunreinigungen sind, um mögliche Ausgasungen in einer Hochvakuumumgebung zu vermeiden10,11. Da biologische Proben meist aus Wasser bestehen, sind zusätzliche Präparative Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass die einheimischen Strukturen erhalten bleiben.
Die erhaltene Auflösung basiert auf der Optimierung von Vorbereitungsmethoden, die für Probentypen und verwendete Instrumentparameter spezifisch sind. Daher ist es notwendig, die Verwendung von generalisierten Verarbeitungsschritten für alle Gewebetypen zu vermeiden. Einige biologische Proben benötigen eine weniger strenge Verarbeitung, um ihre Struktur zu erhalten, während für empfindliche Probentypen möglicherweise mehr Zeit und Sorgfalt erforderlich sind, um das Einbringen von Trocknungsartefakten wie Schrumpfung und Kollaps zu vermeiden. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in der SEM-Bildgebung; die Ergebnisse morphometrischer Studien werden durch Probenvorbereitungsverfahren12,13bemerkenswert beeinflusst. Häufige Vorbereitungsschritte für viele biologische Proben sind Fixierung, Dehydrierung und Beschichtung mit einem Metall wie Gold, Platin oder Palladium, um ihre Oberflächen leitfähig für die SEM-Analyse umzuwandeln. Die Art und Kombination der verwendeten Schritte hängt von der Art des Gewebes und den spezifischen Zielen der Studie ab. Ladungsaufbau, Empfindlichkeit gegenüber Vakuum- und Elektronenstrahlschäden stellen Probleme bei der Verarbeitung weicher empfindlicher biologischer Proben dar, was zusätzliche Verarbeitungsschritte erforderlich macht, um die native Struktur des Objekts beizubehalten. Mit konventionellen Methoden wie Osmiumtetroxid-Fixierung, und Dehydrierung verursachen Schrumpfung und den Zusammenbruch von empfindlichen Geweben14,15,16,17. Ziel der Studie ist es, elegante Methoden zu etablieren, die durch die Kombination von Ideen aus früheren Studien mit Modifikationen zur Herstellung und Abbildung von weichen empfindlichen Geweben (z. B. Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen) abgeleitet werden.
Die Auswahl eines geeigneten Befestigungsverfahrens ist der erste wichtigste Schritt für die mikroskopische Analyse biologischer Proben. Die Fixierung des Gewebes unmittelbar nach der Isolierung von einem Organismus ist wichtig, um Veränderungen in ihrer Morphologie durch Zersetzung zu verhindern. Ein wirksames Fixierungsmittel sollte zelluläre Prozesse beenden, indem es die Zellen schnell durchdringt und die Wirkung irreversibel beibehält, um die Struktur der Probe zu stabilisieren, um sowohl nachfolgenden Verarbeitungsschritten als auch einer Untersuchung unter dem SEM17 standzuhalten. , 18. Obwohl mehrere chemische und physikalische Fixierungsmethoden bekannt sind, wird chemische Fixierung häufiger für biologische Proben verwendet, um zelluläre Veränderungen aufgrund von Autolyse-, Verwesungs- und Trocknungseffekten zu vermeiden. Es gibt zahlreiche fixative chemische Formulierungen in der Literatur diskutiert17,19,20,21,22,23, Fixative, die durch Denaturierung und koagierende biologische Makromoleküle und solche, die durch kovalent vernetzung von Makromolekülen fixieren. Alkohole werden als denaturierende Fixative verwendet, die die Ultrastruktur sehr schlecht erhalten und hauptsächlich für die Lichtmikroskopie verwendet werden und nicht für elektronenmikroskopische Analysen empfohlen werden. Vernetzung von Fixativen wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid erzeugen eine intermolekulare und intramolekulare Vernetzung zwischen Makromolekülen innerhalb des Gewebes und bieten eine hervorragende Konservierung von Ultrastrukturen11 ,24,25,26. Biologische Proben sind temperaturempfindlich. Die Temperatur zu Beginn der Fixierung wird empfohlen, 4 °C zu sein, um die laterale Mobilität von Membranproteinen zu reduzieren, die Diffusion interzellulärer Moleküle zu verlangsamen und die Fixierungsrate zu verlangsamen11. Die für die Behebung des Gewebes benötigte Zeit hängt weitgehend von der Größe der Probe und der Geschwindigkeit ab, mit der das Fixierungsmittel mit den Komponenten der Probe diffundiert und reagiert. Eine nächtliche Fixierung in 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd in PBS bei 4 °C ist die bevorzugte Methode für die SEM-Analyse von Proben, die in dieser Studie für ihre sequenziellen penetrativen Eigenschaften verwendet werden, die die Verarbeitung kleinerer empfindlicher Proben ermöglichen17 , 18 , 19 , 20 , 27. Ein Post-Fixierungsschritt mit Osmiumtetroxid wird nicht nur aufgrund seiner toxischen Natur eliminiert, sondern auch festgestellt, dass er keinen zusätzlichen Vorteil zur Verbesserung der Bildqualität für die in dieser Studie analysierten Proben implementiert.
Biologische Proben enthalten Flüssigkeiten, die den SEM-Betrieb stören; Daher müssen die Proben getrocknet werden, bevor sie in die SEM-Probenkammer eingesetzt werden. Sobald die Austrocknung gewährleistet ist, muss das Lösungsmittel aus dem Gewebe entfernt werden, ohne aufgrund der Oberflächenspannung/-trocknung Artefakte in die Proben zu erzeugen. Drei verschiedene Trocknungsmethoden wurden häufig bei der Verarbeitung von Geweben für die SEM-Bildgebung verwendet: Lufttrocknung, kritische Punkttrocknung und Gefriertrocknungsproben28,29,30,31. Wenige Studien berichten von allen drei Trocknungsmethoden, die identische Ergebnisse mit tierischen Gewebeproben28,29,30,31ergeben. Eine allgemeine Praxis, die für kleinere Proben verwendet wird, ist die chemische Dehydrierung durch aufsteigende Konzentrationsreihen von Alkohol und Hexamethyldisilazan (HMDS), aber größere Proben werden mit einem kritischen Punkttrocknungsgerät (CPD)32getrocknet. Während des Trocknungsprozesses bilden sich erhebliche Kräfte in kleinen Hohlräumen, die durch eine Flüssigkeits-/Gasschnittstelle durch die Probe geleitet werden; dies kann sogar zu einem vollständigen Zusammenbruch der Hohlkonstruktionenführen 33. Jede Verformung, die durch die Behandlung auftritt, könnte dann als natives strukturelles Merkmal der Probe verwechselt werden. So sollte das generalisierte Phänomen für die Verarbeitung eliminiert und ein einzigartiger Trocknungsprozess für jeden Gewebetyp standardisiert werden, insbesondere wenn empfindliche Gewebeproben analysiert werden.
In mehreren Versuchen, die mit verschiedenen Kombinationen aller oben genannten Verfahren durchgeführt wurden, standardisierten wir die Methoden, die für die SEM-Analyse von drei empfindlichen Geweben verwendet werden können: Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen. Entwicklungsbiologen und Morphologen beschreiben normale und abnorme Morphogenese während der Embryoentwicklung bei repräsentativen Wirbeltieren. Untersuchungen zu Gensignalwegen hängen von der morphologischen Beschreibung neuartiger Strukturen ab. Um eine abrupte Veränderung der Wirbeltier-Embryostruktur während der SEM-Analyse zu vermeiden, empfehlen wir eine chemische Trocknung nach Austrocknung. Chemische Trocknung mit HMDS ist die relativ neueste Trocknungsmethode und die Vorteile sind relative Schnelligkeit, Benutzerfreundlichkeit, Kostenverluste und das begrenzte Know-how und die benötigte Ausrüstung9. CPD ist eine häufig verwendete Trocknungstechnik, bei der CO2 bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Druck über die Proben hinweg gesteuert wird. Wir haben festgestellt, dass HMDS zum Trocknen von weichen empfindlichen Geweben geeignet ist und die Verarbeitung größerer Proben im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung ermöglicht, die eine umfangreiche Verformung embryonaler Gewebe verursachte. Mehrere Methoden wurden verwendet, um Proben für SEM-Bildgebung vorzubereiten, um die morphologischen Eigenschaften von Pilzen zu untersuchen34. Pilzproben werden häufig in Osmiumtetroxid, gefolgt von Ethanoldehydrierung und kritischer Punkttrocknung, fixiert, was zufriedenstellende Ergebnisse liefern kann, obwohl die toxischen Wirkungen von Osmiumtetroxid6,7,35 und der Verlust von Pilzmaterialien beim Wechsel von Lösungen während der Verarbeitung sind ausgesprochene Nachteile. Die Probenvorbereitungstechnik mit Lufttrocknung ohne Fixierung wurde ebenfalls36 praktiziert, führt aber zu geschrumpften und zusammengebrochenen Strukturen, und die Beobachtung solcher Proben kann leicht falsch interpretiert werden, während die Art charakterisiert wird. Pilz-Hypha verliert seine Integrität in Kontakt mit Flüssigkeiten und eine gleichmäßige Trocknung kann nicht erreicht werden, um die Struktur wiederherzustellen. Aufgrund dieses Effekts wird die Gefriertrocknung häufig zum Trocknen von Weichgeweben wie Pilzmyzel verwendet. Gefriertrocknung funktioniert gut für saubere Materialien, aber das Vorhandensein von Salzen oder Sekretion wird Oberflächendetails verdecken, die nur auf der SEM-Betrachtungsphase identifiziert werden. Wir haben die Gleitkulturmethode mit Glutaraldehyd-Fixierung und kritischer Punkttrocknung gekoppelt, um strukturelle Details intakter Pilzhyphen und Sporen zu ergeben. Obwohl die CPD-Trocknung schrumpfe in Embryonen, führte sie in Verbindung mit der Glutaraldehyd-Fixierung zu gut erhaltenen myzelialen Strukturen. Die Eierschale ist von primärer Bedeutung für den Embryo von eiförmigen Tieren, da sie nicht nur als Schutzhülle fungiert, sondern auch mechanische Stabilität, Durchlässigkeit für Gas und Wasser und eine Kalziumreserve für den sich entwickelnden Embryo bietet. Süßwasserschildkröten-Eierschalen werden aufgrund ihrer Struktur als "starr" eingestuft und aufgrund ihrer Verfügbarkeit von Biologenmitgroßer Aufmerksamkeit 1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Wir beschreiben einfache Methoden zur einfachen Untersuchung von Eierschalen- und Schalenmembranen von lackierten Schildkröten, die auf jede starre Eierschalenart angewendet werden können. Die Methoden der Vorbereitung wurden anhand der resultierenden Bildqualität und reduzierten potenziellen Artefakten bewertet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Obwohl die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) häufig für die ultrastrukturelle Analyse verschiedener biologischer und nichtbiologischer Proben eingesetzt wird, sind Methoden, die an der Verarbeitung verschiedener biologischer Proben beteiligt sind, mit einzigartigen Praktiken verbunden. Alle in der Literatur beschriebenen konventionellen Verfahren zur Verarbeitung von Proben finden immer noch nützliche Anwendungen, aber subtile Änderungen in der Probenvorbereitung können die Bildqualität verändern und Artefakte einführen. Daher ist die Verwendung einer einzigartigen Probenvorbereitungstechnik, die speziell auf die Art des analysierten Gewebes zugeschnitten ist, erforderlich, um ein qualitativ hochwertiges Bild mit ultrastruktureller Auflösung zu erhalten. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der Bereitstellung optimaler Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebende Embryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mit SEM. Die folgenden Optimierungen wurden empfohlen, um gute Ergebnisse für die drei verschiedenen untersuchten empfindlichen biologischen Proben zu erzielen. Die Verwendung von milderen Fixativen wie 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd gefolgt von Dehydrierung mit Ethanol-Serie ist obligatorisch. Pilzmyzel auf Agarblöcken, die durch Gleitkulturen gewonnen werden, ergibt eine bessere ultrastrukturelle Integrität im Vergleich zu Kulturen, die direkt aus Agarplatten stammen. Die chemische Trocknung von Embryonen mit HMDS sorgt für das Trocknen ohne Oberflächenspannung im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung. HMDS verhindert Risse durch Schrumpfung, da Proben beim Trocknen weniger spröde sind. Für die Pilzkultur bietet die kritische Punkttrocknung jedoch eine akzeptable Bildqualität im Vergleich zur chemischen Trocknung. Eierschalen können ohne spezielle Vorbereitungsschritte mit Ausnahme einer gründlichen Waschung und Lufttrocknung vor der Montage abgebildet werden. Die Vorbereitungsmethoden wurden auf der Grundlage einer akzeptablen Bildqualität standardisiert, die bei jeder Studie ermittelt wurde.

Abbildung 1 zeigt die rasterelektronenmikrografische Analyse von gemalten Schildkrötenembryonen (Chrysemys picta). Bemalte Schildkröteneier, die auf einem Einstreumedium gesammelt und inkubiert wurden, die nach der chemischen Trocknung auf Aluminiumstummeln montiert waren, wurden für die SEM-Bildgebung verwendet (Abbildung 1A-E). Eine seitliche Ansicht eines Embryos der Stufe 12 zeigt die craniofacial Strukturen; die Oberkieferpromi...

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Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Wir haben standardisierte Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebungsgemalte Schildkrötenembryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mittels Rasterelektronenmikroskopie. Diese umfassenden Methoden verwenden subtile Änderungen an bekannten Protokollen, um drei empfindliche Gewebe zu verarbeiten, die die Unterscheidung zwischen Originalstrukturen und die Verarbeitung der Artefakte ermöglichen. Mit mir wird Jessica Gibbons, eine Studentin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.Bevor Sie während der Brutzeit Schildkröteneier von einem Feldplatz sammeln, machen Sie vier bis sechs 0,25 Zentimeter große Löcher an den Seiten von Plastikboxen und auf ihren Deckeln, um belüftungzuermöglichen. Vor dem Befüllen der Kisten mit einer feuchten Mischung aus Vermiculit und Torfmoos-Bettmischung im Verhältnis eins zu eins. Entfernen Sie an der Niststelle vorsichtig den Boden, um die Eier aufzudecken, und wischen Sie die Oberfläche jedes Schildkröten-Eis mit einer verdünnten Jodtinktur ab, um sich vor mikrobiellen Verunreinigungen während der Inkubation zu schützen.Legen Sie maximal acht bis neun Eier pro Schachtel in die gleiche Ausrichtung und Ausrichtung, wie sie gelegt wurden, wobei einzelne Kupplungen voneinander getrennt sind. Wenn alle Eier gesammelt wurden, legen Sie die Eier manuell in die Bettwäsche und legen Sie die Deckelboxen für 10 bis 17 Tage in einen 30-Grad-Grad-Inkubator, um die embryonalen Stadien 12, 13 bzw. 18 Embryonen zu erhalten. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Einstreumedium jeden zweiten Tag teilweise zu befeuchten, um Austrocknung zu vermeiden und den Feuchtigkeitsgehalt für die normale Embryoentwicklung aufrechtzuerhalten.Verwenden Sie in der entsprechenden Entwicklungsphase eine spitze Schere, um einen Schnitt auf eine Seite der dorsalen Eierschale und der Eigelbmembran zusammen zu machen, vertikal zur langen Achse des Eis. Als nächstes schneiden Sie die andere Seite des Eis entlang der kurzen Achse, und verwenden Sie Zangen, um das ausgeschnittene Stück mit der Embryoseite nach oben zu schälen. Schneiden Sie die andere Seitliche Seite der Eierschale und legen Sie das ausgeschnittene Stück Schale in PBS.Mit einem Stereomikroskop und Zangen, schälen Sie den Embryo und Diegelbmembran von der Eierschale. Verwenden Sie die Zange und Mikroschere, um die extra embryonalen Membranen zu entfernen, und verwenden Sie einen Embryolöffel, um den Embryo in eine Petrischale mit frischem PBS zu übertragen. Nach dem Abwaschen von Blut und Eigelb bis zu drei Embryonen pro Brunnen einer 12-Well-Platte, die 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für zwei bis drei Tage enthält.Wenn die Proben weiß erscheinen, verwenden Sie Polystyrol-Einsätze mit Polyester-Mesh-Unterteilen, um die Embryonen mit drei fünfminütigen Waschungen in frischen PBS pro Wäsche zu spülen. Nach der letzten Wäsche Proben in einer aufsteigenden Ethanolserie für eine Stunde pro Konzentration dehydrieren. Nach dem zweiten Ethanol-Eintauchen trocknen Sie die Embryonen in einer Reihe von HMDS zu Ethanolkonzentrationen für 20 Minuten pro Eintauchen mit den Petri-Schalen teilweise abgedeckt.Dann legen Sie die Embryonen in eine endgültige 100%HMDS-Lösung, ganz oder teilweise mit einer Dunstabzugshaube über Nacht bedeckt. Langsames Trocknen durch allmähliche Erhöhung der Konzentration von HDMS auf Ethanol ist wichtig, um eine ausgezeichnete Oberflächenstruktur in den Embryonen zu offenbaren. Verwenden Sie am nächsten Morgen doppelstabige sediebelbares Klebeband, um die vollständig getrockneten Proben sorgfältig auf einem Standard-Aluminium-Stift-Stub zu montieren.Wenn alle Proben montiert sind, führen Sie die Proben in die Sputter-Coater-Kammer ein, um die Proben mit einem sehr dünnen Goldfilm für 60 bis 120 Sekunden bei einem 35-Milliamp-Spututter zu beschichten. Befestigen Sie dann die Stellschrauben, um die Stummel auf die entsprechenden Gießplatten zu montieren. Verwenden Sie das Probenaustauschwerkzeug, um den Probenhalter zur Bildgebung in die Probenkammer des Rasterelektronenmikroskops zu übertragen.Um Eierschalen für die Rasterelektronenmikroskopie vorzubereiten, legen Sie die Eierschalen mindestens eine Stunde nach der Embryoernte in destilliertes Wasser, um jegliche Dotter- oder Albuminkontamination zu beseitigen. Als nächstes trocknen Sie die gereinigten Eierschalen auf empfindlichen antistatischen Tüchern in der Dunstabzugshaube über Nacht an die Luft. Bewahren Sie die getrockneten Eierschalen in sauberen Probenflaschen auf, die nach Anzahl und Embryostadium gekennzeichnet sind.Dann montieren, sputtern Mantel und Bild der Eierschalen Proben, wie gerade für die Embryonen gezeigt. Um Gleitpilzkulturen zu etablieren, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um halb bis drei Viertel Zoll Blöcke fester Kartoffeldextrose Agar zu schneiden, und legen Sie die Blöcke auf einzelne Glasmikroskop-Dias. Legen Sie sterile Zahnstocher auf den Boden der sauberen Petrischalen, um die Rutschen von ihnen zu heben, um Oberflächenspannungen zwischen der Platte und der Rutsche zu erzeugen.Legen Sie jede Rutsche auf die Zahnstocher in der Petrischale. Als nächstes verwenden Sie eine sterile Schleife, um Pilze von der Probe inoculum auf jede der vier Seitenseiten eines Agarblocks zu übertragen. Fügen Sie ein paar Tropfen steriles destilliertes Wasser in die Petrischale um die Rutsche, um Feuchtigkeit für die wachsenden Pilze zu gewährleisten.Versiegeln Sie die Platte teilweise mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte im 30 Grad Celsius Inkubator für die entsprechende Brutzeit für die Pilzarten. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Rutsche von der Petrischale und verwenden Sie sterile Zangen, um den fest haftenden Agarblock von der Rutsche in einen Behälter mit 3% Glutaraldehyd für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius zu übertragen. Am nächsten Morgen die Proben in einer aufsteigenden Ethanolserie für 15 Minuten pro Konzentration dehydrieren.Nach dem 90%-Eintauchen die Proben für die endgültige Austrocknung mit zwei 30-minütigen Änderungen in 100%Ethanol verarbeiten, um eine vollständige Sättigung zu gewährleisten, bevor die dehydrierten Proben in die Kammer des kritischen Punkttrocknungsgeräts gegeben werden. Versiegeln Sie die Kammer und öffnen Sie die Ventile, damit flüssiges Kohlendioxid einlüftet und das Ethanol entlüftet wird, bis flüssiges Kohlendioxid die Kammer vollständig füllt. Als nächstes versiegeln und langsam erhitzen, um einen kritischen Punkt zu erreichen, wenn der Kammerdruck 1.000 Pfund Druck pro Quadratzoll überschreitet, die Temperatur 31 Grad Celsius überschreitet und der Flüssigkeits- und Gasraum von Kohlendioxid im Gleichgewicht ist.Dann abtropfen Sie langsam das Kohlendioxid aus der Kammer und der Probe als Gas, um auswirkungen der Oberflächenspannung auf die Probe zu vermeiden, und montieren, verfestigen und stellen Sie die Pilzproben wie gezeigt. Eine seitliche Rasterelektronenmikroskopie eines im Stadium 12 lackierten Schildkrötenembryons zeigt, wie sich die Kieferprominenz über die Unterkiefergrenze hinaus erstreckt und medial eine gut markierte Nasengrube begrenzt. Fünf Pharyngealbögen können ebenfalls beobachtet werden.In einem Embryo der Stufe 15 sind neu gebildete Soden im hinteren Schwanzbereich des Embryos sichtbar, und die Vorderbinnenknospen zeigen kortischer als ventral. Ein klar definiertes Auswachsen eines Karagrückens kann auch entlang des gesamten Zwischen-Flankenbereichs des Embryos visualisiert werden. In Stufe 18 hat sich mit einem leicht umgedrehten unteren Schnabel mit einem Klemmhaken, der in die mittelste Kerbe des oberen Schnabels passt, eine kurze, schwach projizierte Schnauchgebildete gebildet.Der Oberkiefer zeigt ein eingekerbtes Aussehen, und an der Spitze des Oberkiefers bildet sich ein winziger Eierzahn. Die ultrastrukturelle Analyse der Chrysemys picta Eierschale und Schalenmembran durch Rasterelektronenmikroskopie zeigt eine äußere Calcarinus-Eierschalenschicht, die fest an der inneren fadenförmigen Schalenmembran befestigt ist. Die Außenfläche der Eierschale besteht aus gut unterschiedenen mineralisierten Schaleneinheiten aus kugelförmigen Kugelknollen, die in Gruppen und zwischen benachbarten Schaleneinheiten angeordnet sind, mit einer Konzentration von kleinen abgerundeten Vertiefungen oder Poren unterschiedlicher Größe.Gemeinsame Methoden können nicht für alle biologischen Proben verallgemeinert werden, um eine anständige Bildqualität mit SEM zu erreichen. Einzigartige Veränderungen, wie gezeigt, sind für einen bestimmten Gewebetyp unerlässlich. Die chemische und Lufttrocknungsmethode könnte auch für andere organische Proben verwendet werden, und die Kopplungs-Rutschkultur-Technik könnte für alle weichen, robusten mikrobiellen Kulturen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Environment

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Forschung

Umwelt

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