Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד ר דניאל בbaldassarre, SUNY Oswego לדיונים מועילים והערות על כתב היד. מחקר זה היה נתמך על ידי רייס קריק מענקי שותף, Oswego; האתגר מענקים SUNY Oswego הקרן הלאומית למדע (NSF) מענקים קטנים PGL ו-JG.

הערה: הצב הצבוע (כריסמייס פיקטה) ביצים המשמשות במחקר זה נאספו במהלך עונת הקינון של מאי עד יוני 2015-16 מתחנת השדה של רייס קריק, oswego ניו יורק עם אישור המתקבל מהמחלקה הממלכתית של ניו יורק לסביבה שימור (DEC).
1. שיטת ייבוש כימית לעיבוד עוברים עבור SEM
<ol><li>לאסוף ביצי צב מאתרי שדה במ?...

בחדר העבודה שלנו, סוכני קיבעון שונים, התייבשות ושיטות ייבוש נבדקו כדי להכין שלוש דגימות ביולוגיות עדין שונות עבור הדמיה SEM: עוברים, קליפות בביצה, ופטריות בתרבויות. SEM משמש בדרך כלל עבור ניתוח פני השטח, כך חדירה מתוקנת היא פחות בנוגע, אבל זה חייב להיות מובן כי מבנים פנימיים קבוע לקוי יגרום כיו...

סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) אנליזה מבנית ותוספת הדמיה תאיים מיקרוסקופ אור ליצירת פרופיל תלת מימדי של prokaryotes, צמחים, ובעלי חיים. הרזולוציה המרחבית הגבוהה של ה-SEM הופכת אותו לאחת הטכניקות הרב-תכליתיות ורבת העוצמה ביותר הזמינות לבדיקה של מאפייני מיקרו-מבניים של דגימות בקנה מידה של מיקרומטר. דוגמאות מתייבשות נפתרות בפני מבנים טופוגרפיים ובעלי פרטים אינטנסיביים, המספקים את הבסיס לפיתוח מסקנות חוקיות בנוגע ליחסים פונקציונליים1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. כאשר לפרש את התמונות SEM של דגימות ביולוגיות, זה אתגר גדול להבחין בין מבנים מקומיים ואת הפריטים שנוצרו במהלך העיבוד. SEM מופעל בדרך כלל בחללים גבוהים מאוד כדי למנוע כל התערבות של מולקולות גז המשפיעים על הראשי, משני או מפוזרים קורות אלקטרונים הנפלטים מן המדגם10,11. כמו כן, חומרים ביולוגיים רגישים לפגיעה בקרינה בשל המאפיינים הירודים או הלא-מבצעים שלהם. זה חיוני עבור דגימות שנטענו אל SEM להיות יבש לחלוטין וחופשי של כל מזהמים אורגניים כדי לסלק כל החוצה אפשרי בסביבה ואקום גבוהה10,11. כאשר דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר ממים, נדרשים טכניקות מורכבות נוספות כדי להבטיח שמבני הילידים יישמרו.
ההחלטה המתקבלת מבוססת על אופטימיזציה שיטות הכנה ספציפיים סוגי דגימה פרמטרים אינסטרומנטליים מנוצל. לכן, יש צורך להימנע משימוש בשלבי עיבוד כללית לכל סוגי הרקמות. כמה דגימות ביולוגיות ידרוש עיבוד מחמיר פחות כדי לשמר את המבנה שלהם בעוד זמן וטיפול יותר עשוי להיות צורך בסוגים עדינים של דגימות כדי למנוע את המבוא של חפצי ייבוש, כגון הצטמקות והתמוטטות. הכנה לדוגמה היא שלב קריטי בהדמיית SEM; ממצאי מחקרים מורמטרים מושפעים במידה ניכרת מהליכי הכנה לדגימה12,13. שלבי ההכנה המשותפים לדגימות ביולוגיות רבות הן קיבעון, התייבשות וציפוי במתכת כגון זהב, פלטינה או פלדיום כדי להמיר את משטחי הגוף שלהם כדי להיות מוליך לניתוח SEM. האופי והשילוב של השלבים המשמשים ישתנה בהתאם לסוג הרקמה, ולמטרות הספציפיות של המחקר. חיוב הצטברות, רגישות לואקום ולנזק קרן אלקטרוני להוות בעיות בעת עיבוד דגימות ביולוגיות עדין רך, המחייב שלבי עיבוד נוספים כדי לשמור על מבנה מקורי של האובייקט. באמצעות שיטות קונבנציונליות כגון אוסמיום tetroxide תיקון, והתייבשות לגרום הצטמקות ואת התמוטטות של רקמות עדינות14,15,16,17. מטרת המחקר היא להקים מתודולוגיות אלגנטיות הנגזרות משילוב רעיונות ממחקרים קודמים עם שינויים להכנה ותמונה של רקמות עדינות רכות (למשל, עוברי זוחלים, קליפת ביצה של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי).
בחירת שיטת תיקון מתאימה היא הצעד החשוב ביותר לניתוח מיקרוסקופי של דגימות ביולוגיות. תיקון הרקמות מיד לאחר בידוד מאורגניזם הוא חיוני כדי למנוע שינוי במבנה שלהם בשל התפרקות. קבע יעילה צריך לסיים תהליכים סלולריים על ידי הסטת התאים במהירות ושמירה על האפקט באופן הפיך כדי לייצב את מבנה המדגם כדי לעמוד בשני שלבי העיבוד הבאים ובדיקה תחת SEM17 , 18. למרות מספר שיטות הקיבעון הכימי והפיזי ידועים, קיבעון כימי הוא נפוץ יותר עבור דגימות ביולוגיות כדי למנוע כל שינוי הסלולר עקב אוטוליזיס, ריקבון, והשפעות ייבוש. קיימות ניסוחים כימיים מרובים קבע שנדונו בספרות17,19,20,21,22,23, תיקונים שפועלים על ידי מדהרפתקאות ו קרו קרוש ביולוגית, ואלה שפותרים על ידי הקרו מקושרת באמצעות החוצה. האלכוהול משמשים לטיפול במיקרוסקופיה ששמרו על מבנה האולטרסאונד בצורה מאוד גרועה ומשמשים בעיקר למיקרוסקופ אור ולא מומלץ לניתוח אלקטרון מיקרוסקופי. הקושרות בין התיקונים האחרים כמו פורמלדהיד, גלוטרלדהיד ואוסמיום tetroxide יוצרים מחתך מולקולרי ומולקולרי בין הקרו בתוך הרקמות, ומספקים שימור מצוין של מבנים אולטרה-מימריים11 ,24,25,26. דגימות ביולוגיות רגישות לטמפרטורה. הטמפרטורה בתחילת קיבעון מומלץ להיות 4 ° צ' כדי להפחית את הניידות לרוחב של חלבונים ממברנה, כדי להאט את הדיפוזיה של מולקולות התרבות, ולהאט את שיעור הקיבעון11. הזמן הנדרש לתיקון רקמות תלוי במידה רבה בגודל של המדגם ואת המהירות שבה הקיבעון מפזרת ומגיב עם המרכיבים של הדגימה. קיבעון לילה ב 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטאלדהיד ב-PBS ב-4 ° c היא השיטה המועדפת עבור ניתוח SEM של דגימות המשמשות במחקר זה עבור מאפייני החדירה הרציפה שלהם, אשר מאפשרים דגימות עדינות קטנות יותר לעיבוד17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 27. צעד לאחר קיבוע עם אוסמיום tetroxide מסולק לא רק בשל טבעו הרעיל אלא גם מצא ליישם שום יתרון נוסף כדי לשפר את איכות התמונה עבור דגימות שנותחו במחקר זה.
דגימות ביולוגיות מכילות נוזלים המפריעים לפעולת SEM; מכאן, הדגימות צריך להתייבש לפני הכנסתו לתא לדוגמה SEM. לאחר התייבשות מובטחת, את הממס יש להסיר מן הרקמה מבלי ליצור ממצאים לתוך הדגימות בשל מתח פני השטח/ייבוש. שלוש שיטות ייבוש שונות היו בשימוש נפוץ במהלך רקמות עיבוד עבור הדמיה SEM: ייבוש האוויר, במצב קריטי ייבוש, ו להקפיא הקפאה דגימות28,29,30,31. מחקרים מעטים מדווחים על שלוש שיטות הייבוש המייצרות תוצאות זהות עם דגימות רקמה בעלי חיים28,29,30,31. תרגול כללי המשמש לדגימות קטנות יותר הן התייבשות כימית על-ידי סדרת הריכוז העולה של אלכוהול ו-הבוחנים (HMDS), אך דגימות גדולות יותר מיובשות באמצעות מכשיר לייבוש בנקודה קריטית (CPD)32. בתהליך הייבוש, כוחות ניכרים הנוצרים בחללים קטנים העוברים דרך הדגימה באמצעות ממשק נוזלי/גז; זה יכול אפילו לגרום לקריסה מלאה של המבנים חלול33. כל דפורמציה המתרחשים בשל הטיפול יכול להיות טועה כתכונה מבנית יליד של הדגימה. לפיכך, התופעה הוכללת לעיבוד יש לסלק ותהליך ייבוש ייחודי צריך להיות מתוקננת עבור כל סוג של רקמה במיוחד כאשר דגימות רקמה עדינה מנותח.
בכמה מבחנים שנערכו באמצעות שילוב שונים של כל התהליכים הנ ל, אנו מתוקננת את השיטות שניתן להשתמש בהן עבור ניתוח SEM של שלוש רקמות עדינות: עוברי זוחלים, קליפות בביצים של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי. ביולוגים ומורפוללוגים התפתחותיים מתארים מורפולגנזה נורמלית ובלתי נורמלית במהלך התפתחות העובר בבעלי חוליות מייצגים. חקירות על המסלולים גנטי איתות תלוי בתיאור מורפולוגית של מבנים חדשניים. כדי למנוע כל שינוי פתאומי במבנה העובר בעלי חוליות במהלך ניתוח SEM, אנו ממליצים על ייבוש כימי בעקבות התייבשות. ייבוש כימי באמצעות HMDS היא שיטת הייבוש החדשה יחסית והיתרונות כוללים מהירות יחסית, קלות שימוש, אובדן עלות, ואת המומחיות מוגבלת וציוד צריך9. CPD היא טכניקת ייבוש בשימוש נפוץ באמצעות passaging CO2 על פני הדגימות בטמפרטורה מסוימת ולחץ. זיהינו כי HMDS מתאים לייבוש רקמות עדינות רכות ומאפשר דגימות גדולות יותר להיות מעובד בהשוואה נקודה קריטית ייבוש, אשר גרם דפורמציה נרחבת רקמות עובריים. מספר שיטות שימשו כדי להכין דגימות עבור הדמיה SEM כדי ללמוד את המאפיינים מורפולוגיים של פטריות34. דגימות פטרייתי הם בדרך כלל קבוע ב אוסמיום tetroxide ואחריו התייבשות אתנול ובנקודה קריטית ייבוש, אשר עשוי לספק תוצאות משביעות רצון, למרות ההשפעות הרעילות של אוסמיום tetroxide6,7,35 ולאבד חומרים פטרייתיים תוך שינוי פתרונות במהלך העיבוד מבטאים חסרונות. טכניקת ההכנה לדוגמה באמצעות ייבוש האוויר ללא קיבעון היתה גם התאמן36 אבל התוצאות של מבנים צומק ו התמוטט, ותצפית של דגימות כאלה יכול בקלות להיות מפורש בזמן אפיון המינים. Hypha פטרייתי מאבד את שלמות במגע עם נוזלים ואף ייבוש לא ניתן להשיג כדי לשחזר את המבנה. בשל השפעה זו, ייבוש ההקפאה משמש בדרך כלל לייבוש רקמות רכות כמו פטריות מיצליום. ייבוש ההקפאה עובד היטב חומרים נקיים, אבל הנוכחות של מלחים או הפרשה יהיה לטשטש פרטי השטח כי יזוהו רק בשלב הצפייה SEM. אנו מצמידים את שיטת תרבות השקופיות עם תיקון glutarאלדהיד ואת הנקודה הקריטית ייבוש כדי להניב פרטים מבניים של מיקוף פטרייתי שלמים ונבגים. למרות CPD ייבוש הצטמקות העוברים, זה הביא גם מבנים mycelial היטב כאשר ביחד עם קיבעון גלוטרלדהיד. קליפת המעטפת היא בעלת חשיבות עיקרית לעובר בעלי חיים בלתי-מכניים על-ידי הפעלת כיסוי הגנתי, אלא גם מתן יציבות מכנית, חדירות לגז ומים, ושמורת סידן לעובר המתפתח. כדורי הביצה של צב המים המתוקים מסווגים כ"קשיחים" המבוססים על המבנה שלהם, ובגלל זמינותם קיבלו תשומת לב משמעותית מהביולוגים1,2,3,4 , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , 37 , 38.
אנו לפרט שיטות פשוטות לבדיקה קלה של קרום קליפת הקליפה של צב צבוע שניתן להחיל על כל מיני ביצה נוקשה. מתודולוגיות הכנה הוערכו על בסיס איכות התמונה וכתוצאה מכך מופחתת חפצים פוטנציאליים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

למרות שסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) משמשת רבות לניתוח במיוחד של דגימות ביולוגיות ולא ביולוגיות שונות, שיטות המעורבות בעיבוד דגימות ביולוגיות שונות כרוכות בשיטות ייחודיות. כל השיטות הקונבנציונליות שתוארו בספרות לעיבוד דגימות עדיין למצוא יישומים שימושיים, אבל שינויים עדינים בהכנה לדוגמה יכול לשנות את איכות התמונה, כמו גם, להציג פריטים. מכאן, באמצעות טכניקה ייחודית הכנה לדוגמה ספציפית לסוג של רקמה מנותח נדרש כדי לקבל תמונה באיכות טובה עם רזולוציה ultraקונסטרוקטיבית. המוקד של מחקר זה הוא לספק את הפרוטוקולים האופטימליים להכנת לדוגמה עבור עוברי הדמיה, קליפות בביצה נוקשה, ו פטרייתי תרבויות באמצעות SEM. המיטובים הבאים היו מומלצים להניב תוצאות טובות עבור שלושת הדגמים הביולוגיים העדינים שנחקרו. שימוש של תיקונים מתון כמו 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטארלדהיד ואחריו התייבשות עם סדרת אתנול הוא הכרחי. פטרייתי תפטיר על בלוקים אגר שהתקבלו על ידי תרבויות שקופיות תשואות שלמות מבנית טובה יותר בהשוואה לתרבויות נלקח ישירות צלחות אגר. ייבוש כימי של העוברים עם HMDS מספק ייבוש מבלי להציג את המתח משטח המים בהשוואה הנקודה הקריטית ייבוש. HMDS מונע סדיקה הנגרמת על ידי הצטמקות כמו דגימות שבירות פחות במהלך הייבוש. עם זאת, עבור תרבות פטרייתיים, ייבוש נקודה קריטית מספק איכות תמונה מקובלת לעומת ייבוש כימי. קליפות בביצה ניתן לתמונה ללא שלבי הכנה מיוחדים מלבד כביסה יסודית וייבוש האוויר לפני ההרכבה. מתודולוגיות הכנה היו מתוקננת בהתבסס על איכות תמונה מקובלת שהושגו עם כל משפט.

איור 1 הצג סריקת מיקרוגרפיה אלקטרונית של צב צבוע (כריסמייס picta) עוברים. ביצי צב צבוע שנאספו ומודחים על מצעים בינונית, רכוב על האלומיניום לאחר ייבוש כימיים שימשו הדמיה SEM (איור 1א-ה). מבט לרוחב של העובר שלב 12 מראה את מבנים הגולגולת; הגדולה הלסת התחת...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי עיבוד מפורטים לדימות דגימות רקמה עדינה באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM). שלוש שיטות עיבוד שונות, כלומר, האודיאתיל disilazana (HMDS) ייבוש כימי, ייבוש אוויר פשוט, וייבוש נקודה קריטית מתוארים להכנת קליפות בביצה נוקשה, עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדם, ותרבויות פטרייתי בהתאמה.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

יש לנו פרוטוקולי הכנה מדגמיים סטנדרטיים להדמיית עוברי צבים צבועים, קליפות ביצים נוקשות ותרבויות פטרייתיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה. שיטות מקיפות אלה משתמשות בשינויים עדינים לפרוטוקולים ידועים כדי לעבד שלוש רקמות עדינות המאפשרות הבחנה בין מבנים מקוריים ועיבוד הממצאים. הפגנת ההליך איתי תהיה ג'סיקה גיבונס, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.לפני איסוף ביצי צב מאתר שדה בעונת הקינון, לעשות ארבעה עד שישה חורים 0.25 ס"מ לאורך הצדדים של קופסאות פלסטיק על המכסים שלהם כדי לאפשר אוויר. לפני מילוי הקופסאות בתערובת לחה של תערובת מצעים של ורמיקוליט וטחב כבול ביחס של אחד לאחד. באתר הקינון, להסיר בעדינות את האדמה כדי לחשוף את הביצים ולנגב את פני השטח של כל ביצת צב עם תמיסת יוד מדוללת כדי להגן מפני זיהום מיקרוביאלי במהלך הדגירה.מניחים מקסימום של שמונה עד תשע ביצים לכל תיבה באותו כיוון ויישור כפי שהם הונחו, שמירה על אחיזות בודדות נפרדות זו מהשנייה. כאשר כל הביצים נאספו, באופן ידני לקבור את הביצים חצי המצעים ולה מניחים את תיבות חבצלות בתוך אינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 17 ימים כדי לקבל שלבים עובריים 12, 13 ו 18 עוברים בהתאמה. מוסיפים מים מזוקקים כדי להרטיב חלקית את מדיום המצעים כל יומיים כדי למנוע התייבשות, ולשמור על רמת הלחות להתפתחות עוברית תקינה.בשלב המתאים של הפיתוח, השתמש במספריים מחודדים כדי לבצע חתך בצד אחד של קליפת הביצה הגבית וממברנת החלמון יחד, אנכי לציר הארוך של הביצה. לאחר מכן, חותכים את הצד השני של הביצה לאורך הציר הקצר, ולהשתמש מדפים לקלף לפתוח את החתיכה excised עם הצד העובר למעלה. חותכים את הצד הצדדי השני של קליפת הביצה ומ מניחים את חתיכת הקליפה הנכרתת לתוך PBS.באמצעות סטריאומיקרוסקופ ומלקיחות, לקלף את העובר ואת קרום החלמון מן קליפת הביצה. השתמש במטסים ובמיקרו מספריים כדי להסיר את הממברנות העובריות הנוספות, ולהשתמש בכף עובר כדי להעביר את העובר לצלחת פטרי של PBS טרי. לאחר שטיפת כל דם וחלמון, מניחים עד שלושה עוברים לכל באר של צלחת 12 באר, המכיל 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים.כאשר הדגימות מופיעות לבנות, השתמשו בתוספים פוליסטירן עם תחתיות רשת פוליאסטר כדי לשטוף את העוברים עם שלוש חמש דקות שטיפה ב- PBS טרי לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, לייבש דגימות בסדרת אתנול עולה במשך שעה אחת לכל ריכוז. לאחר טבילת האתנול השנייה, ייבשו את העוברים בסדרה של HMDS לריכוזי אתנול למשך 20 דקות לטבילה עם צלחות פטרי מכוסות חלקית.לאחר מכן מניחים את העוברים בתתכונת HMDS סופית של 100%, מכוסה לחלוטין או חלקית במכסה המנוע של האדים בן לילה. ייבוש איטי על ידי הגדלה הדרגתית של ריכוז HDMS לאתנול חשוב לחשיפת מבנה משטח מעולה בעוברים. למחרת בבוקר, השתמש בקלטת מוליך פחמן מקל כפול כדי להרכיב בזהירות את הדגימות מיובשות לחלוטין על תקע סיכת אלומיניום סטנדרטי.כאשר כל הדגימות כבר רכוב, להציג את הדגימות לתוך תא מעיל sputter כדי לצפות את הדגימות עם סרט דק מאוד של זהב במשך 60 עד 120 שניות ב sputter 35 מיליאמפר. לאחר מכן הדקו היטב את ברגי הסט כדי לטעון את הדקים על לוחות היציצה המתאימים. השתמש בכלי חילופי הדגימה כדי להעביר את מחזיק הדגימה לתא הדגימה של מיקרוסקופ האלקטרונים הסריקה להדמיה.כדי להכין קליפות ביצים לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, מניחים את קליפות הביצים במים מזוקקים לפחות שעה לאחר קציר העובר כדי למנוע כל זיהום חלמון או אלבומין. לאחר מכן, האוויר מייבש את קליפות הביצים המנוקות על מגבונים אנטי-סטטיים עדינים במכסה המנוע של האדים במהלך הלילה. אחסן את קליפות הביצים המיובשות בבקבוקי דגימה נקיים, המסומנים לפי מספר ושלב העובר.לאחר מכן, הר, מעיל sputter ותמונה דגימות קליפת הביצה כפי שהוכח רק עבור העוברים. כדי להקים תרבויות פטרייתיות שקופיות, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך חצי עד שלושה בלוקים אינץ 'של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מוצק, ולמקם את הבלוקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות. מניחים קיסמים סטריליים בתחתית מנות פטרי נקיות להעלאת שקופיות מהם כדי ליצור מתח פנים בין הצלחת למגלשה.מניחים כל שקופית על קיסמים בצלחת פטרי. לאחר מכן, השתמש בלולאה סטרילית כדי להעביר פטריות מאינוקולום הדגימה לכל אחד מארבעת הצדדים הצדדיים של גוש אגר. הוסיפו כמה טיפות מים מזוקקים סטריליים לצלחת הפטרי סביב המגלשה כדי להבטיח לחות לפטריות הגדלות.לאטום חלקית את הצלחת עם סרט פרפין ולה מניחים את הצלחת באינקובטור 30 מעלות צלזיוס לתקופת הדגירה המתאימה למין הפטרייתי. בסוף הדגירה, להסיר את השקופית מן צלחת פטרי ולהשתמש מדפים סטריליים להעביר את גוש אגר דבק בחוזקה מן השקופית למיכל של 3% glutaraldehyde עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לייבש את הדגימות בסדרת אתנול עולה במשך 15 דקות לכל ריכוז.לאחר טבילה של 90%, מעבדים את הדגימות להתייבשות סופית עם שני שינויים של 30 דקות באתנול של 100% כדי להבטיח רוויה מלאה לפני הצבת הדגימות המיובלות בתא של מנגנון הייבוש של הנקודה הקריטית. לאטום את התא ולפתוח את השסתומים כדי לאפשר פחמן דו חמצני נוזלי לפרוק פנימה ולתת אתנול לפרוק החוצה עד פחמן דו חמצני נוזלי לחלוטין ממלא את התא. לאחר מכן, לאט לאט לחמם את התא כדי להשיג נקודה קריטית כאשר לחץ התא עולה על 1,000 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע, הטמפרטורה עולה על 31 מעלות צלזיוס, ואת שטח הנוזל והגז של פחמן דו חמצני הוא שיווי משקל.ואז לאט לאט לנקז את הפחמן הדו חמצני מהתא ואת המדגם כגז, כדי למנוע כל השפעות של מתח פני השטח על המדגם, הר, צלחת, ותמונה דגימות פטרייתי כפי שהוכח. תצוגת מיקרוגרף אלקטרונים סריקה רוחבית של עובר צב צבוע שלב 12 מגלה כיצד בולטות maxillary משתרעת מעבר למלדיברולרי ומדיאלי מגביל בור האף מסומן היטב. חמש קשתות הלוע ניתן לראות גם.בעובר שלב 15, somites שזה עתה נוצרו נראים באזור הזנב האחורי של העובר, ואת ניצנים הקדמיים להצביע בצורה קליפתית יותר מאשר ventrally. ניתן גם לדמיין תפוקה מוגדרת היטב של רכס שריון לאורך כל אזור האגף הבין-יבשתי של העובר. בשלב 18, חוטם הקרנה קצר וקצר נוצר עם מקור תחתון מעט הפוך עם וו מסוף שמתאים לחיץ המרכזי של המקור העליון.הלסת העליונה מציגה מראה חרוט, ו ניתן לראות שן ביצה זעירה המתגבשת בקצה הלסת העליונה. ניתוח אולטרה-מבני של קליפת הביצה של קריסמיס פיקטה וקרום הקליפה על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, חושף שכבת קליפת קלקרינוס החיצונית, המחוברת היטב לקרום הקליפה הפנימי. המשטח החיצוני של קליפת הביצה מורכב מיחידות מעטפת מינרליות מכובדות היטב עשויות גושים כדוריים כדוריים המסודרים בקבוצות ובין יחידות מעטפת סמוכות, עם ריכוז של שקעים מעוגלים קטנים או נקבוביות בגדלים שונים.מתודולוגיות נפוצות לא ניתן להכליא עבור כל הדגימה הביולוגית כדי להשיג איכות תמונה הגון באמצעות SEM. שינויים ייחודיים כפי שהוכח חיוניים עבור סוגי רקמות ספציפיים. השיטה הכימית וייבוש האוויר יכולה לשמש גם עבור דגימות אורגניות אחרות, ואת טכניקת תרבות שקופיות צימוד יכול לשמש עבור כל רכים, תרבויות מיקרוביאליות חזקות.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

חידוש פני השטח: שיטה מתקדם Micrometeorological למדידה ועיבוד שדה בקנה מידת אנרגיה שטף נתוני צפיפות

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

שיטות עיבוד נתונים סיסמיים הדמיה ממוחשבת של הרי געש מהסבא: יישומים הבזלת טארים המבול

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

סריקה Conductometry (TSC) כמו ג ' לים כללי שיטת לימוד ושליטה על ההתנהגות שלב גופניים מוליך תרמי

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

תפוקה גבוהה, פרוטוקול Microscale על ניתוח של עיבוד פרמטרים ועל איכויות תזונתיות ב תירס (זיה מייז ל')

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

הכנה לדוגמה שיטת סריקה ומיקרוסקופ אלקטרון שידור לתוספות של החיפושית המשעממת

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...