Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego per le discussioni e i commenti utili sul manoscritto. Questo studio è stato sostenuto da Rice Creek Associate Grants, Oswego; Sfida concede SUNY Oswego e National Science Foundation (NSF) Small Grants a PGL e JG.

NOTA: le uova di tartaruga dipinta (Chrysemys picta) utilizzate in questo studio sono state raccolte durante la stagione di nidificazione da maggio a giugno 2015-16 dalla Rice Creek Field Station, Oswego New York con il permesso ottenuto dal Dipartimento ambientale dello Stato di New York Conservazione (DEC).
1. Metodo di essiccazione chimica per la lavorazione degli embrioni per SEM
<ol><li>Raccogli le uova di tartaruga dai campi durante la stagione della nidificazione. Preparare i...

Nel nostro studio, diversi agenti di fissazione, metodi di disidratazione e essiccazione sono stati testati per preparare tre diversi campioni biologici delicati per l'imaging SEM: embrioni, gusci di uova e colture fungine. SeM è comunemente usato per l'analisi della superficie, quindi la penetrazione fissativa è meno preoccupante, ma bisogna capire che strutture interne scarsamente fissate causeranno restringimento verso l'interno o/e strutture superficiali collassate. Il tempo di fissazione prolungato deve essere con...

L'analisi ultrastrutturale del microscopio elettronico a scansione (SEM) e l'imaging intracellulare completano la microscopia luminosa per la profilazione tridimensionale di procadioti, piante e animali. L'elevata risoluzione spaziale di un SEM lo rende una delle tecniche più versatili e potenti disponibili per l'esame delle caratteristiche microstrutturali dei campioni su scala nanometrica a micrometro. Gli esemplari desicizzati sono deferiti a strutture compositive e topografiche con intensi dettagli, che forniscono le basi per lo sviluppo di valide conclusioni sulle relazioni funzionali1,2,3 , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. Quando si interpretano immagini SEM di campioni biologici, è una grande sfida distinguere tra le strutture native e gli artefatti creati durante la lavorazione. SeM è generalmente azionato a vuoto molto elevato per evitare interferenze da molecole di gas che interessano i fasci di elettroni primari, secondari o backscattered emessi dal campione10,11. Inoltre, i materiali biologici sono soggetti a danni da radiazioni a causa delle loro proprietà scarse o non conduttrici. È essenziale che gli esemplari caricati nel SEM siano completamente asciutti e privi di contaminanti organici per eliminare ogni possibile outgassing in un ambiente ad alto vuoto10,11. Poiché gli esemplari biologici sono per lo più composti da acqua, sono necessarie tecniche di preparativa aggiuntive per garantire che le strutture native siano mantenute.
La risoluzione ottenuta si basa sull'ottimizzazione dei metodi di preparazione specifici per i tipi di campioni e i parametri strumentali utilizzati. Pertanto, è necessario evitare l'utilizzo di passaggi di elaborazione generalizzati per tutti i tipi di tessuto. Alcuni campioni biologici richiederanno una lavorazione meno rigorosa per preservare la loro struttura, mentre potrebbero essere necessari più tempo e cura per i tipi delicati di campioni per evitare l'introduzione di manufatti di essiccazione, come il restringimento e il collasso. La preparazione del campione è un passaggio critico nell'imaging SEM; i risultati degli studi morfometrici sono notevolmente influenzati dalle procedure di preparazione dei campioni12,13. Le misure di preparazione comuni per molti campioni biologici sono fissazione, disidratazione e rivestimento con un metallo come oro, platino o palladio per convertire le loro superfici in conduttivo per l'analisi SEM. La natura e la combinazione dei passi utilizzati variano a seconda del tipo di tessuto e degli obiettivi specifici dello studio. L'accumulo di carica, la sensibilità al danno del vuoto e del fascio di elettroni pongono problemi durante l'elaborazione di campioni biologici delicati morbidi, che richiedono ulteriori fasi di lavorazione per mantenere la struttura nativa dell'oggetto. L'utilizzo di metodi convenzionali come il fissaggio del tetrossido di osmio e la disidratazione causano restringimento e il collasso di tessuti delicati14,15,16,17. Lo scopo dello studio è quello di stabilire metodologie eleganti derivate combinando idee da studi precedenti con modifiche per preparare e immagini tessuti delicati morbidi (ad esempio, embrioni di rettili, guscio d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine).
La scelta di un metodo di fissaggio adatto è il primo passo più importante per l'analisi microscopica di campioni biologici. Fissare i tessuti immediatamente dopo l'isolamento da un organismo è essenziale per prevenire l'alterazione nella loro morfologia a causa della decomposizione. Un efficace fissativo dovrebbe terminare i processi cellulari permeando rapidamente le cellule e mantenendo l'effetto in modo irreversibile per stabilizzare la struttura del campione per resistere a entrambe le fasi di elaborazione successive e l'esame ai sensi del SEM17 , 18.Sebbene siano noti diversi metodi di fissaggio chimici e fisici, la fissazione chimica è più comunemente utilizzata per i campioni biologici per evitare qualsiasi cambiamento cellulare dovuto all'autolisi, alla putrefazione e agli effetti di essiccazione. Ci sono numerose formulazioni chimiche fissative discusse nella letteratura17,19,20,21,22,23, fissativi che funzionano denatura e coagulando macromolecole biologiche, e quelle che si fissano covalentmente incrociando macromolecole. Gli alcoli sono utilizzati come fissativi didenazione che conservano l'ultrastruttura molto scarsa e sono utilizzati principalmente per la microscopia leggera e non raccomandati per l'analisi microscopica elettronica. I fissativi come la formaldeide, la glutaraldeide e il tetrossido di osmio creano un incrocio intermolecolare e intramolecolare tra macromolecole all'interno dei tessuti, fornendo un'eccellente conservazione delle ultrastrutture11 ,24,25,26. I campioni biologici sono sensibili alla temperatura. La temperatura all'inizio della fissazione è raccomandata per essere di 4 gradi centigradi per ridurre la mobilità laterale delle proteine della membrana, per rallentare la diffusione delle molecole intercellulari e rallentare il tasso di fissazione11. Il tempo necessario per fissare i tessuti dipende in gran parte dalle dimensioni del campione e dalla velocità con cui il fissativo diffonde e reagisce con i componenti del campione. Una fissazione notturna in paraformaldeide del 4% o 3% di glutaraldeide in PBS a 4 gradi centigradi è il metodo preferito per l'analisi SEM dei campioni utilizzati in questo studio per le loro proprietà penetranti sequenziali, che consentono l'elaborazione di campioni delicati più piccoli17 , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 27. Una fase post-fissazione con tetrossido di osmio viene eliminata non solo a causa della sua natura tossica, ma anche per non implementare alcun vantaggio aggiuntivo per migliorare la qualità dell'immagine per i campioni analizzati in questo studio.
I campioni biologici contengono fluidi che interferiscono con l'operazione SEM; quindi, i campioni devono essere essiccati prima di inserirlo nella camera campione SEM. Una volta garantita la disidratazione, il solvente deve essere rimosso dal tessuto senza creare artefatti nei campioni a causa della tensione/essiccazione superficiale. Sono stati comunemente utilizzati tre diversi metodi di essiccazione durante la lavorazione dei tessuti per l'imaging SEM: essiccazione dell'aria, essiccazione a punti critici e congelamento dei campioni di essiccazione28,29,30,31. Pochi studi riportano tutti e tre i metodi di essiccazione producendo risultati identici con campioni di tessuto animale28,29,30,31. Una pratica generale utilizzata per i campioni più piccoli è la disidratazione chimica mediante la concentrazione crescente di serie di alcol e hexamethyldisilazane (HMDS), ma i campioni più grandi vengono essiccati utilizzando uno strumento di essiccazione a punti critici (CPD)32. Durante il processo di essiccazione, notevoli forze formate in piccole cavità che vengono passate attraverso il campione da un'interfaccia liquido/gas; questo può anche portare ad un crollo completo delle strutture cave33. Qualsiasi deformazione dovuta al trattamento potrebbe quindi essere scambiata come caratteristica strutturale nativa del campione. Pertanto, il fenomeno generalizzato per la lavorazione dovrebbe essere eliminato e un processo di essiccazione unico dovrebbe essere standardizzato per ogni tipo di tessuto, soprattutto quando vengono analizzati campioni di tessuto delicati.
In diversi studi condotti utilizzando varie combinazioni di tutti i processi di cui sopra, abbiamo standardizzato i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi SEM di tre tessuti delicati: embrioni di rettili, gusci d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine. I biologi e i morfologi dello sviluppo descrivono la morfogenesi normale e anormale durante lo sviluppo dell'embrione in animali vertebrati rappresentativi. Le indagini sulle vie di segnalazione genica dipendono dalla descrizione morfologica di nuove strutture. Per evitare bruschi cambiamenti nella struttura dell'embrione dei vertebrati durante l'analisi SEM, si consiglia l'essiccazione chimica dopo la disidratazione. L'essiccazione chimica con HMDS è il metodo di essiccazione relativamente più recente e i vantaggi includono la relativa rapidità, la facilità d'uso, la perdita dei costi e la limitata competenza e le attrezzature necessarie9. Il CPD è una tecnica di essiccazione comunemente utilizzata che utilizza il passaggio di CO2 attraverso i campioni a una temperatura e pressione specifiche. Abbiamo identificato che hmDS è adatto per l'essiccazione di tessuti delicati molli e consente di elaborare campioni più grandi rispetto all'essiccazione a punti critici, che ha causato un'estesa deformazione ai tessuti embrionali. Sono stati utilizzati diversi metodi per preparare campioni per l'imaging SEM per studiare le caratteristiche morfologiche dei funghi34 . Gli esemplari fungini sono comunemente fissati nel tetrossido di osmio seguito da disidratazione dell'etanolo e essiccazione a punti critici, che può fornire risultati soddisfacenti, anche se gli effetti tossici del tetrossido di osmio6,7,35 e perdere materiali fungini mentre si cambiano le soluzioni durante la lavorazione sono svantaggi pronunciati. Anche la tecnica di preparazione dei campioni che utilizza l'essiccazione ad aria senza fissazione è stata praticata36, ma si traduce in strutture rimpicciolite e collassate, e l'osservazione di tali campioni può essere facilmente interpretata erroneamente mentre caratterizza la specie. L'hypha fungina perde la sua integrità a contatto con i liquidi e un'essiccazione uniforme potrebbe non essere raggiunta per ripristinare la struttura. A causa di questo effetto, l'essiccazione automatica è comunemente usata per asciugare tessuti molli come il micelio fungino. L'essiccazione congelante funziona bene per i materiali puliti, ma la presenza di sali o secrezioni oscurerà i dettagli superficiali che saranno identificati solo nella fase di visualizzazione SEM. Abbiamo accoppiato il metodo di coltura slide con il fissaggio della glutaraldeide e l'essiccazione dei punti critici per produrre dettagli strutturali di hyphae e spore fungine intatte. Anche se l'essiccazione da CPD ha causato restringimento negli embrioni, ha portato a strutture miceliali ben conservate quando accoppiato con fissazione della glutaraldeide. Il guscio d'uovo è di primaria importanza per l'embrione di animali ovipari non solo agendo come copertura protettiva, ma fornendo anche stabilità meccanica, permeabilità al gas e all'acqua e una riserva di calcio per l'embrione in via di sviluppo. I gusci delle uova di tartaruga d'acqua dolce sono classificati come "rigidi" in base alla loro struttura, e grazie alla loro disponibilità hanno ricevuto un'attenzione significativa dai biologi1,2,3,4 , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 37 Mi lasa' di , 38.
Dettagliamo metodi semplici per un facile esame delle membrane di guscio e guscio di tartaruga dipinta che può essere applicato a qualsiasi specie rigida di guscio d'uovo. Le metodologie di preparazione sono state valutate in base alla qualità dell'immagine risultante e alla riduzione dei potenziali artefatti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Sebbene la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia ampiamente utilizzata per l'analisi ultrastrutturale di vari campioni biologici e non biologici, i metodi coinvolti nell'elaborazione di diversi campioni biologici coinvolgono pratiche uniche. Tutte le pratiche convenzionali descritte nella letteratura per l'elaborazione dei campioni trovano ancora applicazioni utili, ma sottili cambiamenti nella preparazione dei campioni possono alterare la qualità dell'immagine, così come, introdurre artefatti. Pertanto, l'utilizzo di una tecnica di preparazione campione unica specifica per il tipo di tessuto analizzato è necessario per ottenere un'immagine di buona qualità con risoluzione ultrastrutturale. L'obiettivo di questo studio è fornire i protocolli ottimali di preparazione del campione per l'imaging di embrioni, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando SEM. Le seguenti ottimizzazioni sono state raccomandate per produrre buoni risultati per i tre diversi delicati campioni biologici studiati. L'uso di fissativi più lievi come 4% paraformaldeide o 3% glutaraldeide seguita da disidratazione con serie di etanolo è obbligatorio. Il micelio fungino sui blocchi di agar ottenuti dalle colture di scorrimento produce una migliore integrità ultrastrutturale rispetto alle colture prese direttamente dalle piastre di agar. L'essiccazione chimica degli embrioni con HMDS fornisce l'essiccazione senza introdurre artefatti di tensione superficiale rispetto all'essiccazione a punti critici. HMDS previene la fessurazione causata dal restringimento poiché i campioni sono meno fragili durante l'essiccazione. Tuttavia, per la coltura fungina, l'essiccazione a punti critici fornisce una qualità dell'immagine accettabile rispetto all'essiccazione chimica. I gusci d'uovo possono essere immagini senza particolari passaggi di preparazione, ad eccezione del lavaggio completo e dell'essiccazione dell'aria prima del montaggio. Le metodologie di preparazione sono state standardizzate in base alla qualità accettabile dell'immagine ottenuta con ogni prova.

La figura 1 mostra l'analisi micrografica elettronica a scansione degli embrioni della tartaruga dipinta (Chrysemys picta). Per l'imaging SEM sono state utilizzate uova di tartaruga verniciate raccolte e incubate su un supporto da letto, montate su mozziconi di alluminio a seguito di essiccazione chimica (Figura 1A-E). Una vista laterale di un embrione di fase 12 mostra le strutture craniofacciali; la prominenza mascellare si estende o...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Elaborazione della coltura embrionale, del guscio d'uovo e fungina per la microscopia elettronica a scansione

Qui presentiamo protocolli di elaborazione dettagliati per l'imaging di campioni di tessuti delicati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo, l'essiccazione dell'aria semplice e l'essiccazione a punti critici, sono descritti per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo e colture fungine.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Abbiamo protocolli standardizzati di preparazione dei campioni per l'imaging di embrioni di tartarughe dipinte, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando la microscopia elettronica a scansione. Questi metodi completi utilizzano sottili alterazioni dei protocolli noti per elaborare tre tessuti delicati che consentono la differenziazione tra strutture originali e l'elaborazione degli artefatti. A dimostrare la procedura con me sarà Jessica Gibbons, una studentessa laureata del mio laboratorio.Prima di raccogliere le uova di tartaruga da un sito di campo durante la stagione di nidificazione, fai da quattro a sei fori da 0,25 centimetri lungo i lati delle scatole di plastica e sui loro coperchi per consentire l'aerazione. Prima di riempire le scatole con una miscela umida di vermiculite e torba muschio biancheria da letto miscela ad un rapporto uno a uno. Nel sito di nidificazione, rimuovere delicatamente il terreno per scoprire le uova e pulire la superficie di ogni uovo di tartaruga con una tintura diluita di iodio per proteggere dalla contaminazione microbica durante l'incubazione.Posizionare un massimo di otto-nove uova per scatola nello stesso orientamento e allineamento in cui sono state deposte, mantenendo le singole frizioni separate l'una dall'altra. Una volta raccolte tutte le uova, seppellire manualmente le uova a metà nella biancheria da letto e posizionare le scatole lidded all'interno di un'incubatrice Celsius di 30 gradi per 10-17 giorni per ottenere rispettivamente stadi embrionali 12, 13 e 18 embrioni. Aggiungere acqua distillata per bagnare parzialmente il mezzo di lettiera a giorni diversi per evitare la disidratazione e mantenere il livello di umidità per il normale sviluppo dell'embrione.Nella fase appropriata di sviluppo, utilizzare forbici appuntite per fare un taglio su un lato del guscio d'uovo dorsale e della membrana del tuorlo insieme, verticalmente al lungo asse dell'uovo. Quindi, tagliare l'altro lato dell'uovo lungo l'asse corto e utilizzare le forcelle per sbucciare il pezzo asportato con il lato embrionale verso l'alto. Tagliare l'altro lato laterale del guscio d'uovo e posizionare il pezzo di guscio asportato in PBS.Utilizzando uno stereomicroscopio e forceps, sbucciare l'embrione e la membrana del tuorlo dal guscio d'uovo. Utilizzare le forcep e le micro forbici per rimuovere le membrane embrionali extra e utilizzare un cucchiaio embrionale per trasferire l'embrione in una piastra di Petri di PBS fresco. Dopo aver lavato via sangue e tuorlo, posizionare fino a tre embrioni per pozzo di una piastra da 12 po ', contenente il 4% di paraformaldeide a quattro gradi Celsius per due o tre giorni.Quando i campioni appaiono bianchi, utilizzare inserti in polistirolo con fondo in rete di poliestere per risciacquare gli embrioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo per un'ora per concentrazione. Dopo la seconda immersione in etanolo, asciugare gli embrioni in una serie di concentrazioni da HMDS a etanolo per 20 minuti per immersione con le piastre di Petri parzialmente coperte.Quindi mettere gli embrioni in un'ultima soluzione 100%HMDS, completamente o parzialmente coperta in una cappa aspirante durante la notte. L'essiccazione lenta aumentando gradualmente la concentrazione di HDMS in etanolo è importante per rivelare un'eccellente struttura superficiale negli embrioni. La mattina successiva, utilizzare nastro conduttivo in carbonio a doppio bastoncino per montare con cura i campioni completamente essiccati su uno stub standard in alluminio.Una volta montati tutti i campioni, introdurre i campioni nella camera del rivestimento dello sputter per rivestire i campioni con una pellicola d'oro molto sottile per 60-120 secondi a uno sputter da 35 milliamp. Quindi fissare saldamente le viti impostate per montare gli stub sulle corrispondenti piastre di versamento. Utilizzare lo strumento di scambio del campione per trasferire il portacampioni nella camera campione del microscopio elettronico a scansione per l'imaging.Per preparare i gusci d'uovo per la microscopia elettronica a scansione, posizionare i gusci d'uovo in acqua distillata per almeno un'ora dopo il raccolto dell'embrione per eliminare qualsiasi contaminazione da tuorlo o albumina. Successivamente, asciugare all'aria i gusci d'uovo puliti su delicate salviette antistabiliche nel cappuccio dei fumi durante la notte. Conservare i gusci d'uovo essiccati in bottiglie di campioni puliti, etichettati per numero e stadio embrionale.Quindi, montare, sputter cappotto e immagine gli esemplari guscio d'uovo come appena dimostrato per gli embrioni. Per stabilire colture fungine di scorrimento, utilizzare un bisturi sterile per tagliare da metà a tre quarti di pollice di agar di destrosio di patate solide e posizionare i blocchi sui singoli vetrini del microscopio di vetro. Posizionare gli stuzzicadenti sterili sul fondo delle piastre di Petri pulite per sollevare gli scivoli da esse per creare tensione superficiale tra la piastra e lo scivolo.Posizionare ogni diapositiva sugli stuzzicadenti nella piastra di Petri. Successivamente, utilizzare un anello sterile per trasferire funghi dall'inoculo del campione a ciascuno dei quattro lati laterali di un blocco di agar. Aggiungere alcune gocce di acqua distillata sterile alla piastra di Petri intorno allo scivolo per garantire l'umidità per i funghi in crescita.Sigillare parzialmente la piastra con pellicola di paraffina e posizionare la piastra nell'incubatrice di 30 gradi Celsius per il periodo di incubazione appropriato per le specie fungine. Alla fine dell'incubazione, rimuovere lo scivolo dalla piastra di Petri e utilizzare forcep sterili per trasferire il blocco di agar strettamente aderenti dallo scivolo a un contenitore di glutaraldeide al 3% per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo per 15 minuti per concentrazione.Dopo l'immersione al 90%, elaborare i campioni per la disidratazione finale con due variazioni di 30 minuti in etanolo al 100% per garantire una saturazione completa prima di posizionare i campioni disidratati nella camera dell'apparato critico di essiccazione a punti. Sigillare la camera e aprire le valvole per consentire all'anidride carbonica liquida di sfogarsi e lasciare sfogare l'etanolo fino a quando l'anidride carbonica liquida non riempie completamente la camera. Quindi, sigillare e riscaldare lentamente la camera per ottenere un punto critico quando la pressione della camera supera i 1.000 libbre di pressione per pollice quadrato, la temperatura supera i 31 gradi Celsius e lo spazio liquido e gassoso dell'anidride carbonica è in equilibrio.Quindi drenare lentamente l'anidride carbonica dalla camera e dal campione come gas, per evitare qualsiasi effetto della tensione superficiale sul campione e montare, placcare e immaginire i campioni fungini come dimostrato. Una visione della micrografia elettronica a scansione laterale di un embrione di tartaruga dipinta allo stadio 12 rivela come la prominenza mascellare si estenda oltre il limite mandibolare e medialmente una fossa nasale ben marcata. Si possono anche osservare cinque archi faringei.In un embrione di fase 15, i somiti appena formati sono visibili nella regione posteriore della coda dell'embrione e le gemme dell'articolo anteriore puntano più cortamente che ventralmente. Una crescita ben definita di una cresta carapace può anche essere visualizzato lungo l'intera regione del fianco interlimb dell'embrione. Allo stadio 18, si è formato un muso corto e debolmente proiettante con un becco inferiore leggermente rovesciato con un gancio terminale che si inserisce nella tacca centrale del becco superiore.La mascella superiore mostra un aspetto dentellato e si può vedere un piccolo dente d'uovo che si forma sulla punta della mascella superiore. L'analisi ultrastrutturale del guscio d'uovo chrysemys picta e della membrana del guscio mediante microscopia elettronica a scansione, rivela uno strato esterno di guscio d'uovo calcarinus, saldamente attaccato alla membrana interna del guscio filamentoso. La superficie esterna del guscio d'uovo è costituita da ben distinte unità di guscio mineralizzato fatte di noduli sferici globulari disposti in gruppi e tra unità di guscio adiacenti, con una concentrazione di piccole depressioni arrotondate o pori di varie dimensioni.Le metodologie comuni non possono essere generalizzate per tutti i campioni biologici per ottenere una qualità dell'immagine decente utilizzando SEM. Le alterazioni uniche come dimostrato sono essenziali per uno specifico tipo di tessuto. Il metodo di essiccazione chimica e ad aria potrebbe essere utilizzato anche per altri campioni organici e la tecnica di coltura dello scivolo di accoppiamento potrebbe essere utilizzata per tutte le colture microbiche morbide e robuste.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Rinnovo di superficie: un metodo avanzato micrometeorologici per la misurazione e l&#39;elaborazione del campo scala dell&#39;energia densità di flusso di dati

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Ricerca

Ambiente

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l&#39;esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Metodi di elaborazione dei dati per l'Imaging 3D sismica del sottosuolo vulcani: applicazioni per il basalto dell'inondazione del Tarim

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Termica a scansione Conduttometria (TSC) come un metodo generale per studiare e controllare il comportamento di fase di conduttivo fisico gel

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Alto-rendimento, Microscale protocollo per l'analisi dei parametri di elaborazione e qualità nutrizionali in mais (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...