Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego for nyttige diskusjoner og kommentarer om manuskriptet. Denne studien ble støttet av Rice Creek førsteamanuensis Grants, Oswego; Challenge Grants SUNY Oswego og National Science Foundation (NSF) små tilskudd til PGL og JG.

Merk: malt skilpadde (Chrysemys picta) egg brukt i denne studien ble samlet i løpet av hekkende sesongen av mai til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillatelse innhentet fra New York State Department of Environmental Bevaring (desember).
1. kjemisk tørking metode for å behandle embryo for SEM
<ol><li>Samle skilpadde egg fra feltet områder i hekketiden. Forbered inkubasjons kamre på forhånd, laget av plast bokser med lokk (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 ...

I vår studie, ulike fiksering agenter, dehydrering og tørking metoder ble testet for å forberede tre ulike delikate biologiske prøver for SEM Imaging: embryo, eggeskall, og fungal kulturer. SEM er vanligvis brukes til overflate analyse, så bindemiddel penetrasjon er mindre om, men det må forstås at dårlig fast indre strukturer vil føre innover krymper eller/og kollapset overflatestrukturer. Forlenget fiksering tid bør også vurderes for større vevsprøver, erstatte bindemiddel løsningen et par ganger avhengig...

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastructural analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensjonal profilering av prokaryoter, planter og dyr. Den høye romlig oppløsning av en SEM gjør den til en av de mest allsidige og kraftige teknikker tilgjengelig for undersøkelse av mikrostrukturelle karakteristikker av prøvene på nanometer til mikrometer skala. Desiccated prøver løses til struktur og topografiske strukturer med intense detaljer, som gir grunnlaget for å utvikle gyldige konklusjoner om funksjonelle forhold1,2,3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9. Når tolke SEM bilder av biologiske prøver, er det en stor utfordring å skille mellom innfødte strukturer og gjenstander som er opprettet under behandling. SEM er generelt operert ved svært høye vacuums å unngå interferens fra gass molekyler som påvirker den primære, sekundære eller tilbakespredte elektron bjelker slippes ut fra prøven10,11. Også biologiske materialer er mottakelige for stråling skader på grunn av deres fattige eller ikke-gjennomfører egenskaper. Det er viktig for prøvene lastet inn i SEM å være helt tørt og fritt for eventuelle organiske forurensninger for å eliminere eventuelle outgassing i et høyt vakuum miljø10,11. Som biologiske prøver er hovedsakelig sammensatt av vann, ytterligere preparativ teknikker er nødvendig for å sikre at de innfødte strukturene beholdes.
Oppløsningen oppnådd er basert på optimalisering forberedelser metoder spesifikke for prøvetyper og instrumental parametre utnyttet. Derfor er det nødvendig å unngå å bruke generalisert behandlingstrinn for alle vevstyper. Noen biologiske prøver vil kreve mindre strenge prosessering for å bevare sin struktur, mens mer tid og omsorg kan være nødvendig for delikate typer prøver for å unngå innføring av tørking gjenstander, for eksempel krymping og kollaps. Prøve utarbeidelse er et kritisk trinn i SEM Imaging; funnene i morphometric studier er bemerkelsesverdig påvirket av prøve Forberedelses prosedyrer12,13. Felles forberedelse skritt for mange biologiske prøver er fiksering, dehydrering og belegg med et metall som gull, platina eller Palladium å konvertere sine overflater for å være ledende for SEM analyse. Naturen og kombinasjonen av trinnene som brukes vil variere avhengig av type vev, og de konkrete målene for studien. Lad oppbygging, følsomhet for vakuum og elektronstråle skade utgjør problemer ved behandling av myke delikate biologiske prøver, nødvendiggjør ytterligere behandlingstrinn for å beholde den opprinnelige strukturen av objektet. Ved hjelp av konvensjonelle metoder som Osmium tetroxide festing, og dehydrering forårsake krymping og sammenbruddet av delikate vev14,15,16,17. Målet med studien er å etablere elegante metoder avledet ved å kombinere ideer fra tidligere studier med modifikasjoner for å forberede og bilde myke delikate vev (f. eks, reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder, og fungal kulturer).
Valg av en passende feste metode er det første viktigste steget for mikroskopisk analyse av biologiske prøver. Fikse vevet umiddelbart etter isolere fra en organisme er avgjørende for å hindre endring i deres morfologi på grunn av nedbrytning. En effektiv bindemiddel bør avslutte cellulære prosesser ved permeating cellene raskt og opprettholde effekten irreversibelt å stabilisere strukturen av prøven til å tåle både påfølgende behandling trinn og undersøkelse under SEM17 , 18. selv om flere kjemiske og fysiske fiksering metoder er kjent, kjemisk fiksering er mer vanlig å bruke for biologiske prøver å unngå eventuelle cellulære endringer på grunn av autolyse, forråtnelse, og tørking effekter. Det er mange bindemiddel kjemiske formuleringer diskutert i litteraturen17,19,20,21,22,23, fiksativene som fungerer ved denaturering og coagulating biologiske makromolekyler, og de som løser ved covalently kryss-linking makromolekyler. Alkoholer brukes som denaturering fiksativene som bevarer Ultrastructure svært dårlig og brukes mest for lette mikroskopi og ikke anbefalt for elektron mikroskopisk analyse. Cross-Linking fiksativene som formaldehyd, glutaraldehyde, og Osmium tetroxide skape Intermoleylære og intramolekylær Cross Linking mellom makromolekyler innen vev, gir utmerket bevaring av ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiske prøver er følsomme for temperatur. Temperaturen i begynnelsen av fiksering anbefales å være 4 ° c for å redusere den laterale mobilitet av membran proteiner, for å bremse spredningen av intercellulære molekyler, og for å bremse hastigheten på fiksering11. Tiden som kreves for å fikse vev avhenger i stor grad av størrelsen på prøven og hastigheten som bindemiddel diffunderer og reagerer med komponentene i prøven. En overnatting fiksering i 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde i PBS ved 4 ° c er den foretrukne metoden for SEM analyse av prøver som brukes i denne studien for deres sekvensielle penetrative egenskaper, som tillater mindre delikate prøver å bli behandlet17 , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 27. en post-fiksering trinn med Osmium tetroxide elimineres ikke bare på grunn av sin giftige natur, men også funnet å gjennomføre ingen ekstra fordel å forbedre bildekvaliteten for prøvene analysert i denne studien.
Biologiske prøver inneholder væsker som forstyrrer SEM-operasjonen; derav, prøvene må tørkes før du setter den i SEM prøve kammer. Når dehydrering er sikret, må løsemiddel fjernes fra vevet uten å skape gjenstander i prøvene på grunn av overflaten spenning/tørking. Tre forskjellige tørking metoder ble ofte brukt under prosessering vev for SEM Imaging: lufttørking, kritisk punkt tørking, og frysetørking prøver28,29,30,31. Få studier rapporterer alle tre tørking metoder som produserer identiske resultater med animalsk vev prøver28,29,30,31. En generell praksis som brukes for mindre eksemplarer er kjemisk dehydrering av stigende konsentrasjons serie av alkohol og hexamethyldisilazane (HMDS), men større eksemplarer er tørket ved hjelp av et kritisk punkt tørking (CPD) instrument32. Under tørkeprosessen, store krefter dannet i små hulrom som er gått gjennom prøven med en væske/gass-grensesnitt; Dette kan også føre til en fullstendig kollaps av hul strukturene33. Enhver deformasjon som oppstår på grunn av behandlingen kan deretter forveksles som en innfødt strukturell funksjon av prøven. Dermed bør generalisert fenomen for behandling elimineres og en unik tørkeprosessen bør være standardisert for hver type vev spesielt når delikate vevsprøver analyseres.
I flere forsøk utført ved hjelp av ulike kombinasjoner av alle de ovennevnte prosesser, standardiserte vi metodene som kan brukes til SEM analyse av tre delikate vev: reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder og sopp kulturer. Utviklingsmessige biologer og morphologists beskriver normal og unormal morphogenesis under embryoutvikling i representative virveldyr dyr. Undersøkelser på gen signalering trasé avhenge av morfologiske beskrivelse av romanen strukturer. For å unngå brå endringer i embryo Foster strukturen under SEM-analyse, anbefaler vi kjemisk tørking etter dehydrering. Kjemisk tørking ved hjelp av HMDS er den relativt nyeste tørke metoden og fordelene inkluderer relativ hurtighet, brukervennlighet, tapt kostnad, og den begrensede kompetansen og utstyret som trengs9. CPD er en ofte brukt tørking teknikk ved hjelp passaging CO2 over prøvene ved en bestemt temperatur og trykk. Vi identifiserte at HMDS er egnet for tørking mykt delikat vev og tillater større prøver å bli behandlet i forhold til kritisk punkt tørking, noe som forårsaket omfattende deformasjon til embryonale vev. Flere metoder har blitt brukt til å forberede prøvene for SEM Imaging å studere morfologiske karakteristikker av sopp34. Sopp prøver er vanligvis løst i Osmium tetroxide etterfulgt av etanol dehydrering og kritisk punkt tørking, som kan gi tilfredsstillende resultater, selv om toksiske effekter av Osmiumtetroxide35 og miste sopp materialer mens skiftende løsninger under behandling er uttalt ulemper. Prøven forberedelse teknikken bruker luft-tørking uten fiksering har også vært praktisert36 men resulterer i krympet og kollapset strukturer, og observasjon av slike prøver kan lett bli misforstått mens karakteriserer arten. Fungal hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en enda tørking kan ikke oppnås for å gjenopprette strukturen. På grunn av denne effekten, fryse-tørking brukes vanligvis for tørking bløtvev som sopp mycel. Frysetørking fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen av noen salter eller sekresjon vil skjule overflate detaljer som vil bli identifisert bare på SEM ser scenen. Vi koblet raset kulturen metoden med glutaraldehyde festing og kritisk punkt tørking å gi strukturelle detaljer intakt fungal hyfer og sporer. Selv om CPD tørking forårsaket krymping i embryo, resulterte det i godt bevarte Mycelial strukturer når kombinert med glutaraldehyde fiksering. Eggeskall er av primær betydning for fosteret av oviparous dyr ved å ikke bare opptre som en beskyttende dekker, men også gi mekanisk stabilitet, permeabilitet til gass og vann, og en kalsium Reserve for utviklingsland embryo. Freshwater Turtle eggeskall er klassifisert som "rigid" basert på deres struktur, og på grunn av deres tilgjengelighet har fått betydelig oppmerksomhet fra biologer1,2,3,4 , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 37 for alle , i 38.
Vi detaljer enkle metoder for enkel undersøkelse av eggeskall og skall membraner av malte skilpadde som kan brukes på alle stive eggeskall arter. Forberedelses metoder ble evaluert basert på resulterende bildekvalitet og reduserte potensielle artefakter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Selv om skanning elektron mikroskopi (SEM) blir mye brukt for den ultra-strukturelle analyse av ulike biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder involvert i behandling av ulike biologiske prøver innebære unik praksis. Alle konvensjonelle praksiser beskrevet i litteraturen for behandling prøvene fortsatt finne nyttige programmer, men subtile endringer i prøven preparatet kan endre bildekvalitet, samt, innføre artefakter. Herav, benytter en enestående eksemplar forberedelse teknikk spesifikk å typen av tissue analysert er krevde å få en fint kvalitet image med ultrastructural resolution. Fokuset i denne studien er å gi den optimale prøven forberedelse protokoller for Imaging embryo, stive eggeskall, og fungal kulturer bruker SEM. Følgende optimaliseringer ble anbefalt å gi gode resultater for de tre forskjellige delikate biologiske prøver studert. Bruk av mildere fiksativene som 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde etterfulgt av dehydrering med etanol-serien er obligatorisk. Fungal mycel på agar blokker innhentet av lysbilde kulturer gir en bedre ultrastructural integritet i forhold til kulturer tatt direkte fra agar plater. Kjemisk tørking av embryo med HMDS gir tørking uten å innføre overflate spennings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørking. HMDS hindrer sprekker forårsaket av krymping som prøvene er mindre sprø under tørking. For sopp kultur gir imidlertid kritisk punkt tørking akseptabel bildekvalitet sammenlignet med kjemisk tørking. Eggeskall kan bli avbildet uten spesielle Forberedelses trinn, bortsett fra grundig vasking og lufttørking før montering. Forberedelses metoder ble standardisert basert på akseptabel bildekvalitet oppnådd med hvert forsøk.

Figur 1 Vis skanning elektron hhv analyse av malt skilpadde (Chrysemys picta) embryo. Malte skilpadde egg samlet og inkubert på et sengetøy medium, montert på aluminium stubber etter kjemisk tørking ble brukt for SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning av en etappe 12 embryo viser kraniofacial strukturer; maksillære prominence strekker seg utover søvnapnéskinne og begrenser en godt merket nese pit anteriort; fem pharyngeal b...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Prosessering embryo, eggeskall, og fungal kultur for Scanning Electron mikroskopi

Her presenterer vi detaljerte behandlingsprotokoller for Imaging delikate vevsprøver ved hjelp av skanning elektron mikroskopi (SEM). Tre ulike behandlingsmetoder, nemlig hexamethyl disilazana (HMDS) kjemisk tørking, enkel lufttørking og kritisk punkt tørking er beskrevet for å forberede stive eggeskall, embryo på tidlige utviklingsmessige stadier, og fungal kulturer hhv.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Vi har standardiserte prøveforberedelsesprotokoller for avbildning av malte skilpaddeembryoer, stive eggeskall og soppkulturer ved hjelp av skanning av elektronmikroskopi. Disse omfattende metodene bruker subtile endringer i kjente protokoller for å behandle tre delikate vev som tillater differensiering mellom originale strukturer og behandling av artefaktene. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Jessica Gibbons, en utdannet student fra laboratoriet mitt.Før du samler skilpaddeegg fra et feltområde i hekkesesongen, gjør du fire til seks 0,25 centimeter hull langs sidene av plastbokser og på lokkene for å tillate vanning. Før du fyller boksene med en fuktig blanding av vermikulitt og torvmose sengetøy blanding på en en til en ratio. På hekkestedet fjerner du forsiktig jorda for å avdekke eggene og tørk overflaten av hvert skilpaddeegg med en fortynnet jodtinktur for å beskytte mot mikrobiell forurensning under inkubasjon.Plasser maksimalt åtte til ni egg per boks i samme retning og justering som de ble lagt, holde individuelle clutcher atskilt fra hverandre. Når alle eggene er samlet inn, begraver eggene manuelt halvparten i sengetøyet og plasserer de lokkede boksene inne i en 30 graders Celsius inkubator i henholdsvis 10 til 17 dager for å oppnå embryonale stadier 12, 13 og 18 embryoer. Tilsett destillert vann for å delvis fukte sengetøymediet annenhver dag for å unngå dehydrering, og for å opprettholde fuktighetsnivået for normal embryoutvikling.På riktig utviklingsstadium bruker du spiss saks for å lage et kutt på den ene siden av dorsal eggeskall og eggeplommemembran sammen, vertikal til eggets lange akse. Klipp deretter den andre siden av egget langs den korte aksen, og bruk tang til å skrelle åpne det utskåret stykke med embryoet opp. Skjær den andre sidesiden av eggeskallet og legg det utskåret skallet i PBS.Bruk et stereomikroskop og tang, skrell embryoet og eggeplommemembranen fra eggeskallet. Bruk tang og mikrosaks til å fjerne de ekstra embryonale membranene, og bruk en embryoskje til å overføre embryoet til en petriskål med fersk PBS. Etter å ha vasket bort blod og eggeplomme, legg opptil tre embryoer per brønn av en 12-brønnsplate, som inneholder 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius i to til tre dager.Når prøvene ser hvite ut, bruk polystyreninnsatser med polyesternettbunner for å skylle embryoene med tre fem minutters vask i frisk PBS per vask. Etter siste vask dehydrerer du prøver i en stigende etanolserie i en time per konsentrasjon. Etter den andre etanol nedsenking, tørke embryoene i en rekke HMDS til etanol konsentrasjoner i 20 minutter per nedsenking med Petri retter delvis dekket.Plasser deretter embryoene i en endelig 100% HMDS-løsning, helt eller delvis dekket av en røykhette over natten. Langsom tørking ved gradvis å øke konsentrasjonen av HDMS til etanol er viktig for å avsløre en utmerket overflatestruktur i embryoene. Neste morgen, bruk dobbel pinne karbon ledende tape for å nøye montere de helt tørkede prøvene på en standard aluminium pin stub.Når alle prøvene er montert, introdusere prøvene i sputter coater kammeret for å belegge prøvene med en veldig tynn film av gull i 60 til 120 sekunder på en 35 milliamp sputter. Fest deretter settskruene godt for å montere stubbene på de tilsvarende helleplatene. Bruk prøveutvekslingsverktøyet til å overføre prøveholderen til prøvekammeret på skanneelektronmikroskopet for avbildning.For å forberede eggeskall for skanning av elektronmikroskopi, legg eggeskallene i destillert vann i minst en time etter embryohøstingen for å eliminere eggeplomme eller albuminforurensning. Deretter tørker luften de rengjorte eggeskallene på delikate antistatiske kluter i røykhetten over natten. Oppbevar de tørkede eggeskallene i rene prøveflasker, merket etter nummer- og embryostadium.Deretter montere, sputter pels og bilde eggeskall prøver som nettopp demonstrert for embryoer. For å etablere lysbilde soppkulturer, bruk en steril skalpell til å kutte halv til tre kvart tomme blokker av solid potet dextrose agar, og plasser blokkene på individuelle glassmikroskop lysbilder. Plasser sterile tannpirkere på bunnen av rene Petri-retter for å heve lysbilder av dem for å skape overflatespenning mellom platen og lysbildet.Plasser hvert lysbilde på tannpirkerne i petriskålen. Deretter bruker du en steril løkke for å overføre sopp fra prøveinokulumet til hver av de fire laterale sidene av en agarblokk. Tilsett noen dråper sterilt destillert vann til petriskålen rundt sklien for å sikre fuktighet for de voksende soppene.Delvis forsegle platen med parafinfilm og legg platen i 30 grader Celsius inkubator for riktig inkubasjonsperiode for soppartene. På slutten av inkubasjonen, fjern lysbildet fra petriskålen og bruk sterile tang for å overføre den tettsittende agarblokken fra lysbildet til en beholder med 3% glutaraldehyd for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen dehydrerer prøvene i en stigende etanolserie i 15 minutter per konsentrasjon.Etter 90% nedsenking, behandle prøvene for endelig dehydrering med to 30 minutters endringer i 100% etanol for å sikre en fullstendig metning før du plasserer dehydrerte prøvene i kammeret til det kritiske punkttørkingsapparatet. Forsegle kammeret og åpne ventilene slik at flytende karbondioksid kan lufte inn og la etanolventilen ut til flytende karbondioksid fyller kammeret helt. Deretter forsegler og langsomt varmer kammeret for å oppnå et kritisk punkt når kammertrykket overstiger 1000 pounds av trykk per kvadrattomme, temperaturen overstiger 31 grader Celsius, og væske- og gassrommet av karbondioksid er i likevekt.Deretter tapper du sakte karbondioksidet fra kammeret og prøven som en gass, for å unngå eventuelle effekter av overflatespenning på prøven, og montere, plate og bilde soppprøvene som vist. En lateral skanning elektron mikrograf visning av en stadium 12 malt skilpadde embryo avslører hvordan den maksillære prominensen strekker seg utover mandibulær og medially begrenser en godt merket nesegrop. Fem svelgealbuer kan også observeres.I et stadium 15 embryo er nydannede somites synlige på embryoets bakre haleregion, og forbenknoppene peker mer koralt enn ventrikt. En veldefinert utvekst av en karapacerygg kan også visualiseres langs hele interlimb flankeområdet av embryoet. På trinn 18 har en kort svakt projisering snout dannet med et litt oppadrettet nedre nebb med en terminalkrok som passer inn i det sentrale hakket på det øvre nebbet.Overkjeven viser et hakk utseende, og en liten eggtann kan sees danner på spissen av overkjeven. Ultrastrukturell analyse av Chrysemys picta eggeskall og skallmembran ved å skanne elektronmikroskopi, avslører et ytre calcarinus eggeskalllag, fast festet til den indre filamentøse skallmembranen. Den ytre overflaten av eggeskallet består av godt anerkjente mineraliserte skallenheter laget av kuleformede sfæriske knuter arrangert i grupper og mellom tilstøtende skallenheter, med en konsentrasjon av små avrundede fordypninger eller porer av forskjellige størrelser.Vanlige metoder kan ikke generaliseres for alle biologiske prøver for å oppnå en anstendig bildekvalitet ved hjelp av SEM. Unike endringer som demonstrert er avgjørende for en bestemt vevstyper. Den kjemiske og lufttørkende metoden kan også brukes til andre organiske prøver, og koblingsskliekulturteknikken kan brukes til alle myke, robuste mikrobielle kulturer.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Surface Fornyelse: En avansert mikrometeorologiske metode for måling og prosessering Felt-Scale Energy Flux Density data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimalisert negativ farging: en High-throughput Protokoll for Undersøke Liten og Asymmetric Protein struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodal optisk mikros Metoder Avslør Polyp Tissue morfologi og struktur i Caribbean Reef Bygge Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Databehandling metoder for 3D seismikk av undergrunnen vulkaner: programmer Tarim flom Basalt

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Termisk skanning Conductometry (TSC) som en generell metode for å studere og kontrollere fase virkemåten til ledende fysisk Gels

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høy gjennomstrømming, Mikroskala protokollen for analyse av behandling parametere og ernæringsmessige egenskaper i mais (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensjonale (3D)-skrevet mal for høy gjennomstrømning sebrafisk Embryo stiller opp

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Vann fordelingen fra Xylem i Woody Plants

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Prøveforberedelsemetode for skanning og overføring elektron mikroskop for vedlegg av treboring beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...