Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego para discussões úteis e comentários sobre o manuscrito. Este estudo foi apoiado por subsídios associados Rice Creek, Oswego; Concessões do desafio SUNY Oswego e concessões pequenas da Fundação Nacional da ciência (NSF) a PGL e a JG.

Nota: os ovos de tartaruga pintada (Chrysemys picta) utilizados neste estudo foram recolhidos durante a época de nidificação de maio a junho de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York, com permissão obtida do departamento de estado de Nova York de Environmental Conservação (DEC).
1. método de secagem química para processar embriões para SEM
<ol><li>Colete ovos de tartaruga de locais de campo durante a temporada de nidificação. Prepare as câmaras de incubaç?...

Em nosso estudo, diferentes agentes de fixação, métodos de desidratação e secagem foram testados para preparar três diferentes amostras biológicas delicadas para a imagem SEM: embriões, cascas de ovos e culturas fúngicas. O SEM é comumente usado para análise de superfície, de modo que a penetração fixativa é menos preocupante, mas deve ser entendido que estruturas internas mal fixas causarão encolhimento interno ou/e estruturas superficiais colapsadas. O tempo prolongado da fixação deve igualmente ser c...

Análise ultraestrutural do microscópio eletrônico de varredura (SEM) e microscopia de luz intracelular do suplemento da imagem latente para o perfilamento tridimensional dos prokaryotes, das plantas, e dos animais. A alta resolução espacial de um MEV torna uma das técnicas mais versáteis e poderosas disponíveis para o exame de características microestruturais de espécimes no nanômetro para escala de micrômetro. Espécimes dessecados são resolvidos para estruturas composicional e topográficas com detalhes intensos, o que fornece a base para o desenvolvimento de conclusões válidas sobre as relações funcionais1,2,3 , 4. º , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. ao interpretar imagens de sem de espécimes biológicos, é um grande desafio distinguir entre estruturas nativas e os artefatos que são criados durante o processamento. O SEM é operado geralmente em aspiradores muito elevados para evitar toda a interferência das moléculas de gás que afetam os feixes de elétron preliminares, secundários ou backdispersos emitidos da amostra10,11. Também, os materiais biológicos são suscetíveis aos danos da radiação devido a suas propriedades pobres ou não-conduzindo. É essencial para que os espécimes carregados no sem sejam completamente secos e livres de todos os contaminadores orgânicos para eliminar todo o desgaseificação possível em um ambiente elevado do vácuo10,11. Como espécimes biológicos são principalmente compostos de água, técnicas preparativas adicionais são necessárias para garantir que as estruturas nativas são mantidas.
A resolução obtida é baseada na otimização dos métodos de preparo específicos para os tipos de amostras e parâmetros instrumentais utilizados. Assim, é necessário evitar o uso de etapas de processamento generalizado para todos os tipos de tecido. Alguns espécimes biológicos exigirá um processamento menos rigoroso para preservar sua estrutura, enquanto mais tempo e cuidados podem ser necessários para tipos delicados de amostras para evitar a introdução de artefatos de secagem, como encolhimento e colapso. A preparação da amostra é um passo crítico na imagem SEM; os achados dos estudos morfométricos são notavelmente influenciados pelos procedimentos de preparo do espécime12,13. As etapas comuns da preparação para muitas amostras biológicas são fixação, desidratação e revestimento com um metal tal como o ouro, a platina ou o paládio para converter suas superfícies para ser condutoras para a análise de SEM. A natureza e a combinação das etapas utilizadas variarão dependendo do tipo de tecido e dos objetivos específicos do estudo. Acúmulo de carga, sensibilidade ao vácuo e dano de feixe de elétrons colocam problemas ao processar amostras biológicas delicadas suaves, necessitando de etapas adicionais de processamento para reter a estrutura nativa do objeto. O uso de métodos convencionais como a fixação do tetróxido de ósmio e a desidratação causam encolhimento e o colapso dos tecidos delicados14,15,16,17. O objetivo do estudo é estabelecer metodologias elegantes derivadas combinando ideias de estudos anteriores com modificações para preparar e imagem de tecidos delicados macios (por exemplo, embriões de répteis, casca de ovo de tartarugas pintadas e culturas fúngicas).
A seleção de um método apropriado da fixação é a primeira etapa a mais importante para a análise microscópica de espécimes biológicos. A fixação dos tecidos imediatamente após o isolamento de um organismo é essencial para evitar alterações na sua morfologia devido à decomposição. Um fixador eficaz deve encerrar os processos celulares, permeando as células rapidamente e mantendo o efeito irreversivelmente para estabilizar a estrutura da amostra para suportar as etapas de processamento subsequentes e exame o SEM17 , 18. embora diversos métodos químicos e físicos da fixação sejam sabidos, a fixação química é usada mais geralmente para espécimes biológicos para evitar todas as mudanças celulares devido à autólise, ao putrefaction, e aos efeitos de secagem. Existem inúmeras formulações químicas fixativas discutidas na literatura17,19,20,21,22,23, fixativas que trabalham por desnaturação e coagulando macromoléculas biológicas, e aquelas que fixam por macromoléculas de ligação cruzada covalentemente. Os álcoois são usados como fixadores desnaturando que preservam ultraestrutura muito mal e são usados na maior parte para a microscopia de luz e não recomendado para a análise microscópica do elétron. Os fixadores cross-linking como o formaldeído, o glutaraldeído e o tetróxido do ósmio criam o reticulação intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro dos tecidos, fornecendo a preservação excelente das ultra-estruturas11 ,24,25,26. As amostras biológicas são sensíveis à temperatura. Recomenda-se que a temperatura no início da fixação seja de 4 ° c para reduzir a mobilidade lateral das proteínas da membrana, para retardar a difusão das moléculas intercelulares e retardar a taxa de fixação11. O tempo necessário para a fixação dos tecidos depende em grande parte do tamanho da amostra e da velocidade com que o fixador se difunde e reage com os componentes da amostra. Uma fixação durante a noite em paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% em PBS a 4 ° c é o método preferencial para a análise de MeV de espécimes utilizados neste estudo para suas propriedades penetrantes sequenciais, que permitem a transformação de amostras delicadas menores17 , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 27. um passo pós-fixação com tetroxida de ósmio é eliminado não só devido à sua natureza tóxica, mas também não foi encontrado para implementar nenhuma vantagem adicional para melhorar a qualidade da imagem para as amostras analisadas neste estudo.
As amostras biológicas contêm fluidos que interferem na operação de SEM; daqui, as amostras precisam de ser secas antes de inseri-la na câmara da amostra de SEM. Uma vez que a desidratação é assegurada, o solvente deve ser removido do tecido sem criar artefatos nos espécimes devido à tensão de superfície/secagem. Três diferentes métodos de secagem foram comumente utilizados durante o processamento de tecidos para sem imagem: secagem de ar, secagem de ponto crítico e congelamento de amostras de secagem28,29,30,31. Poucos estudos relatam todos os três métodos de secagem produzindo resultados idênticos com amostras de tecido animal28,29,30,31. Uma prática geral usada para espécimes menores são a desidratação química por série de concentração ascendente de álcool e hexametildissilazano (HMDS), mas os espécimes maiores são secos usando um ponto crítico de secagem (CPD) instrumento32. Durante o processo de secagem, forças consideráveis formadas em pequenas cavidades que são passadas através do espécime por uma interface de líquido/gás; Isto pode mesmo conduzir a um colapso completo das estruturas ocas33. Qualquer deformação que ocorra devido ao tratamento pode então ser confundida como uma característica estrutural nativa do espécime. Assim, o fenômeno generalizado para o processamento deve ser eliminado e um processo de secagem original deve ser estandardizado para cada tipo de tecido especial quando os espécimes delicados do tecido são analisados.
Em vários ensaios realizados utilizando várias combinações de todos os processos acima mencionados, padronizamos os métodos que podem ser utilizados para a análise de MeV de três tecidos delicados: embriões de répteis, cascas de ovos de tartarugas pintadas e culturas fúngicas. Biólogos e morfologistas do desenvolvimento descrevem morfogênese normal e anormal durante o desenvolvimento embrionário em animais vertebrados representativos. As investigações sobre as vias de sinalização genética dependem da descrição morfológica das novas estruturas. Para evitar qualquer mudança abrupta na estrutura do embrião de vertebrados durante a análise de SEM, recomendamos a secagem química após a desidratação. A secagem química usando HMDS é o método de secagem relativamente o mais novo e as vantagens incluem o quickness relativo, a facilidade de utilização, o custo perdido, e a perícia e o equipamento limitados necessários9. O CPD é uma técnica de secagem comumente usada usando o de co2 nos espécimes em uma temperatura e pressão específicas. Nós identificamos que HMDS é apropriado para secar tecidos delicados macios e permite que as amostras maiores sejam processadas comparadas à secagem crítica do ponto, que causou a deformação extensiva aos tecidos embrionário. Vários métodos têm sido utilizados para preparar amostras para a imagem SEM para estudar as características morfológicas dos fungos34. Os espécimes fúngicos são comumente fixados em tetroxida de ósmio, seguidos por desidratação de etanol e secagem de ponto crítico, o que pode proporcionar resultados satisfatórios, embora os efeitos tóxicos do ósmio tetroxida6,7,35 e perder materiais fúngicos, enquanto as soluções em mudança durante o processamento são desvantagens pronunciadas. A técnica da preparação da amostra que usa o ar-secagem sem fixação foi praticada igualmente36 mas resultados em estruturas encolhidos e desmoronadas, e a observação de tais espécimes pode facilmente ser interpretada mal ao caracterizar a espécie. A hipha fúngica perde sua integridade em contato com líquidos e uma secagem até mesmo pode não ser alcançada para restaurar a estrutura. Devido a este efeito, a liofilização é comumente usada para secar tecidos moles como micélio fúngico. A secagem por congelamento funciona bem para materiais limpos, mas a presença de quaisquer sais ou secreção obscurecer os detalhes superficiais que serão identificados apenas no estágio de visualização de SEM. Nós acoplamos o método da cultura da corrediça com fixação do glutaraldeído e ponto crítico que secam para render detalhes estruturais de hifas e de spores fungosos intactos. Embora a secagem do CPD causasse o encolhimento nos embriões, conduziu às estruturas micelial bem preservadas quando acoplada com a fixação do glutaraldeído. A casca de ovo é de importância primordial para o embrião de animais oviparosos, não só agindo como uma cobertura protetora, mas também proporcionando estabilidade mecânica, permeabilidade ao gás e água, e uma reserva de cálcio para o embrião em desenvolvimento. As cascas de água doce da tartaruga são classificadas como "rígidas" com base em sua estrutura, e devido à sua disponibilidade têm recebido atenção significativa dos biólogos1,2,3,4 , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 37 , 38.
Nós detalham métodos simples para a examinação fácil da casca de ovo e das membranas da casca da tartaruga pintada que pode ser aplicada a toda a espécie rígida da casca de ovo. As metodologias de preparação foram avaliadas com base na qualidade da imagem resultante e redução de artefatos potenciais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Embora a microscopia eletrônica de varredura (MEV) esteja sendo amplamente utilizada para a análise ultraestrutural de várias amostras biológicas e não biológicas, os métodos envolvidos no processamento de diferentes amostras biológicas envolvem práticas únicas. Todas as práticas convencionais descritas na literatura para processamento de amostras ainda encontram aplicações úteis, mas mudanças sutis na preparação da amostra podem alterar a qualidade da imagem, bem como, introduzir artefatos. Assim, a utilização de uma técnica de preparo de amostra única específica para o tipo de tecido analisado é necessária para obter uma imagem de boa qualidade com resolução ultraestrutural. O foco deste estudo é fornecer os protocolos ideais da preparação da amostra para embriões da imagem latente, cascas de ovo rígidas, e culturas fungosas usando o SEM. As seguintes otimizações foram recomendadas para produzir bons resultados para as três diferentes amostras biológicas delicadas estudadas. O uso de fixadores mais leves como paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% seguido de desidratação com séries de etanol é obrigatório. Micélio fúngico em blocos de agar obtidos por culturas de slides produz uma melhor integridade ultraestrutural em comparação com culturas tomadas diretamente de placas de agar. A secagem química de embriões com HMDS fornece secagem sem introduzir artefatos de tensão superficial em comparação com a secagem de ponto crítico. HMDS previne rachaduras causadas por encolhimento como as amostras são menos frágeis durante a secagem. No entanto, para a cultura fúngica, ponto crítico de secagem fornece qualidade de imagem aceitável em comparação com a secagem química. Os Eggshells podem ser imaged sem etapas especiais da preparação à exceção da lavagem completa e do ar que secam antes da montagem. As metodologias de preparo foram padronizadas com base na qualidade de imagem aceitável obtida com cada ensaio.

Figura 1 mostra análise micrográfica eletrônica de varredura de embriões de tartaruga pintada (Chrysemys picta) . Ovos de tartaruga pintados coletados e incubados em um meio de cama, montados em esboços de alumínio após secagem química, foram utilizados para a imagem SEM (Figura 1a-E). Uma vista lateral de um embrião do estágio 12 mostra as estruturas craniofacial; a proeminência Maxillary estende além do mandibular e limita...

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Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Temos protocolos padronizados de preparação de amostras para embriões de tartarugas pintadas por imagem, cascas de ovos rígidas e culturas fúngicas usando microscopia eletrônica de varredura. Esses métodos abrangentes usam alterações sutis em protocolos conhecidos para processar três tecidos delicados permitindo a diferenciação entre estruturas originais e processamento dos artefatos. Demonstrando o procedimento comigo estará Jessica Gibbons, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Antes de coletar ovos de tartaruga de um campo durante a temporada de desova, faça quatro a seis buracos de 0,25 centímetros ao longo das laterais das caixas de plástico e em suas tampas para permitir a aeração. Antes de encher as caixas com uma mistura úmida de vermiculite e mistura de musgo de turfa em uma proporção de um para um. No local do ninho, remova suavemente o solo para descobrir os ovos e limpe a superfície de cada ovo de tartaruga com uma tintura de iodo diluída para proteger contra contaminação microbiana durante a incubação.Coloque no máximo oito a nove ovos por caixa na mesma orientação e alinhamento que foram colocados, mantendo as embreagens individuais separadas umas das outras. Quando todos os ovos tiverem sido coletados, enterre manualmente os ovos metade na cama e coloque as caixas tampadas dentro de uma incubadora de 30 graus Celsius por 10 a 17 dias para obter estágios embrionários 12, 13 e 18 embriões, respectivamente. Adicione água destilada para molhar parcialmente o meio de cama a cada dois dias para evitar a desidratação, e para manter o nível de umidade para o desenvolvimento normal de embriões.No estágio apropriado de desenvolvimento, use tesoura pontiaguda para fazer um corte em um lado da casca de ovo dorsal e membrana de gema juntos, verticalmente ao longo eixo do ovo. Em seguida, corte o outro lado do ovo ao longo do eixo curto, e use fórceps para descascar a peça excisada com o lado do embrião para cima. Corte o outro lado lateral da casca de ovo e coloque o pedaço de casca extirpado em PBS.Usando um estereómico e fórceps, descasque o embrião e a membrana da gema da casca de ovo. Use as fórceps e micro tesouras para remover as membranas embrionárias extras, e use uma colher de embrião para transferir o embrião para uma placa de Petri de PBS fresco. Depois de lavar qualquer sangue e gema, coloque até três embriões por poço de uma placa de 12 poços, contendo 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius por dois a três dias.Quando as amostras aparecerem brancas, use pastilhas de poliestireno com fundo de malha de poliéster para enxaguar os embriões com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, desidrate as amostras em uma série ascendente de etanol por uma hora por concentração. Após a segunda imersão do etanol, seque os embriões em uma série de HMDS para concentrações de etanol por 20 minutos por imersão com as placas de Petri parcialmente cobertas.Em seguida, coloque os embriões em uma solução final 100% HMDS, completamente ou parcialmente coberta por um capô de fumaça durante a noite. A secagem lenta aumentando gradualmente a concentração de HDMS para etanol é importante para revelar uma excelente estrutura superficial nos embriões. Na manhã seguinte, use fita condutora de carbono de vara dupla para montar cuidadosamente as amostras completamente secas em um pino de alumínio padrão.Quando todas as amostras tiverem sido montadas, introduza as amostras na câmara do espaçador para revestir os espécimes com uma película muito fina de ouro por 60 a 120 segundos em um sputter de 35 miliamperes. Em seguida, aperte com segurança os parafusos do conjunto para montar os stubs nas placas de derramamento correspondentes. Use a ferramenta de troca de amostras para transferir o suporte de amostra para a câmara amostral do microscópio eletrônico de varredura para imagem.Para preparar cascas de ovos para a microscopia eletrônica de varredura, coloque as cascas de ovos em água destilada por pelo menos uma hora após a colheita do embrião para eliminar qualquer contaminação de gema ou albumina. Em seguida, seque as cascas de ovos limpas em delicados lenços antiestáticos no capô da fumaça durante a noite. Armazene as cascas de ovos secos em garrafas de espécimes limpas, rotuladas por número e estágio de embrião.Em seguida, monte, casaco de sputter e imagem os espécimes de casca de ovo como apenas demonstrado para os embriões. Para estabelecer culturas fúngicas de slides, use um bisturi estéril para cortar blocos de meio a três quartos de polegada de ágar de dextrose de batata sólida, e coloque os blocos em slides de microscópio de vidro individuais. Coloque palitos estéreis no fundo de pratos de Petri limpos para levantar slides deles para criar tensão superficial entre a placa e o escorregador.Coloque cada lâmina nos palitos de dente na placa de Petri. Em seguida, use um laço estéril para transferir fungos do inóculo do espécime para cada um dos quatro lados laterais de um bloco de ágar. Adicione algumas gotas de água destilada estéril à placa de Petri ao redor do escorregador para garantir a umidade para os fungos em crescimento.Sele parcialmente a placa com filme de parafina e coloque a placa na incubadora de 30 graus Celsius para o período de incubação adequado para as espécies fúngicas. No final da incubação, remova o slide da placa de Petri e use fórceps estéreis para transferir o bloco de ágar firmemente aderido do slide para um recipiente de 3% glutaraldeído para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, desidrate as amostras em uma série ascendente de etanol por 15 minutos por concentração.Após a imersão de 90%, processe as amostras para desidratação final com duas alterações de 30 minutos em 100% de etanol para garantir uma saturação completa antes de colocar as amostras desidratadas na câmara do aparelho de secagem de ponto crítico. Sele a câmara e abra as válvulas para permitir que o dióxido de carbono líquido venta e deixe o etanol ventilar até que o dióxido de carbono líquido encha completamente a câmara. Em seguida, veda e aqueça lentamente a câmara para alcançar um ponto crítico quando a pressão da câmara excede 1.000 libras de pressão por polegada quadrada, a temperatura excede 31 graus Celsius, e o espaço líquido e gasoso de dióxido de carbono está em equilíbrio.Em seguida, drene lentamente o dióxido de carbono da câmara e da amostra como um gás, para evitar quaisquer efeitos da tensão superficial na amostra, e montar, placa e imagem os espécimes fúngicos como demonstrado. Uma visão de micrografia eletrônica de varredura lateral de um embrião de tartaruga pintado estágio 12 revela como a proeminência maxilar se estende além do mandibular e medialmente limita um poço nasal bem marcado. Cinco arcos faringeais também podem ser observados.Em um embrião estágio 15, os somites recém-formados são visíveis na região posterior da cauda do embrião, e os botões dianteiros apontam mais cortally do que ventrally. Um crescimento bem definido de uma cordilheira de carapaça também pode ser visualizado ao longo de toda a região do flanco interlimb do embrião. Na fase 18, um focinho de projeção desobatada se formou com um bico inferior ligeiramente virado com um gancho terminal que se encaixa no entalhe central do bico superior.A mandíbula superior exibe uma aparência entalhada, e um pequeno dente de ovo pode ser visto se formando na ponta da mandíbula superior. A análise ultraestrutural da casca de ovo de Crisemys picta e da membrana da casca da casca de elétrons, revela uma camada externa de casca de ovo calcarinus, firmemente ligada à membrana da casca de fisomosomia interna. A superfície externa da casca de ovo consiste em unidades de conchas mineralizadas bem distintas feitas de nódulos esféricos globulares dispostos em grupos e entre unidades de conchas adjacentes, com uma concentração de pequenas depressões arredondadas ou poros de vários tamanhos.As metodologias comuns não podem ser generalizadas para que todos os espécimes biológicos alcancem uma qualidade de imagem decente usando SEM. Alterações únicas como demonstrado são essenciais para um tipo específico de tecido. O método de secagem química e de ar também poderia ser usado para outras amostras orgânicas, e a técnica de cultura de slides de acoplamento poderia ser usada para todas as culturas microbianas macias e robustas.

Research

JoVE Journal

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Ambiente

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