Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Författarna skulle vilja tacka doktor Daniel Baldassarre, SUNY Oswego för hjälpsamma diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Denna studie stöddes av Rice Creek associerade stipendier, Oswego; Challenge beviljar SUNY Oswego och National Science Foundation (NSF) små bidrag till PGL och JG.

Obs: målade sköldpadda (Chrysemys picta) ägg som används i denna studie samlades under häckningsperioden maj till juni 2015-16 från Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillstånd från New York State Department of Environmental Bevarande (DEC).
1. kemisk torkmetod för att bearbeta embryon för SEM
<ol><li>Samla sköldpadda ägg från fält platser under häckningssäsongen. Förbered inkuberingskamrarna i förväg, gjorda av plastlådor med lock (L x b x H) 6,7 cm x...

I vår studie testades olika fixeringsmedel, dehydrering och torkmetoder för att förbereda tre olika känsliga biologiska prover för SEM-avbildning: embryon, äggskal och svamp kulturer. SEM används ofta för ytanalys, så fixativ penetration är mindre om, men det måste förstås att dåligt fasta interna strukturer kommer att orsaka inåt krympande eller/och kollapsade ytstrukturer. Förlängd bindningstid bör också övervägas för större vävnadsprover, som ersätter den fixerande lösningen några gånger be...

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturell analys och intracellulära Imaging komplettera ljus mikroskopi för tredimensionell profilering av prokaryoter, växter och djur. Den höga rumsliga upplösningen av en SEM gör den till en av de mest mångsidiga och kraftfulla tekniker som finns för undersökning av mikrostrukturella egenskaper hos prover vid nanometer till mikrometerskalan. Desiccated prover är beslutna att kompositionella och topografiska strukturer med intensiv detalj, som ger Stiftelsen för att utveckla giltiga slutsatser om funktionella relationer1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7 , 8 , 9. vid tolkning av SEM-bilder av biologiska preparat är det en stor utmaning att skilja mellan inhemska strukturer och de artefakter som skapas under bearbetningen. SEM drivs i allmänhet med mycket höga vakuum för att undvika störningar från gasmolekyler som påverkar de primära, sekundära eller bakåtspridda elektronstrålar som avges från provet10,11. Dessutom är biologiskt material mottagliga för strålningsskador på grund av deras fattiga eller icke-ledande egenskaper. Det är viktigt för de prover som lastas i SEM att vara helt torr och fri från alla organiska föroreningar för att eliminera eventuella outgassing i en högvakuum miljö10,11. Eftersom biologiska preparat består mestadels av vatten, krävs ytterligare förberedande tekniker för att säkerställa att de inhemska strukturerna bibehålls.
Den erhållna resolutionen bygger på att optimera förberedelse metoder som är specifika för preparat typer och instrumentella parametrar utnyttjas. Därför är det nödvändigt att undvika att använda generaliserade bearbetningssteg för alla vävnadstyper. Vissa biologiska prover kommer att kräva mindre stränga bearbetning för att bevara sin struktur medan mer tid och omsorg kan behövas för känsliga typer av prover för att undvika införandet av torkning artefakter, såsom krympning och kollaps. Provberedning är ett kritiskt steg i SEM Imaging; resultaten av morphometriska studier är anmärkningsvärt påverkade av preparat berednings procedurerna12,13. Vanliga förberedelsesteg för många biologiska prover är fixering, uttorkning och beläggning med en metall som guld, platina eller Palladium för att omvandla sina ytor för att vara ledande för SEM-analys. Arten och kombinationen av steg som används kommer att variera beroende på vilken typ av vävnad, och de specifika målen för studien. Laddning uppbyggnad, känslighet för vakuum och elektronstråle skador utgör problem vid bearbetning av mjuka känsliga biologiska prover, vilket kräver ytterligare bearbetning steg för att behålla den ursprungliga strukturen av objektet. Använda konventionella metoder som osmium grundämnetetroxide fastställande, och uttorkning orsaka krympning och kollapsen av känsliga vävnader14,15,16,17. Syftet med studien är att etablera eleganta metoder som bygger på att kombinera idéer från tidigare studier med modifikationer för att förbereda och avbilda mjuka, ömtåliga vävnader (t. ex. reptilembryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer).
Val av lämplig infästnings metod är det första viktigaste steget för Mikroskopisk analys av biologiska preparat. Fastställande av vävnader omedelbart efter isolering från en organism är viktigt att förhindra förändring i deras morfologi på grund av nedbrytning. En effektiv fixativ bör avsluta cellulära processer genom att tränga igenom cellerna snabbt och bibehålla effekten oåterkalleligt att stabilisera strukturen i provet för att motstå både efterföljande bearbetning steg och undersökning enligt SEM17 , 18. även om flera kemiska och fysiska fixeringsmetoder är kända, är kemisk fixering oftare används för biologiska prover för att undvika eventuella cellulära förändringar på grund av autolys, förruttnelse, och torkning effekter. Det finns många fixativ kemiska formuleringar som diskuteras i litteraturen17,19,20,21,22,23, fixeringsmedel som fungerar genom att denaturera och koagulerar biologiska makromolekyler, och de som fixas av kovalent tvärbindning av makromolekyler. Alkoholer används som denaturerande fixeringsmedel som bevarar ultrastruktur mycket dåligt och används mest för ljusmikroskopi och rekommenderas inte för elektron Mikroskopisk analys. Tvärbindning fästmedel som formaldehyd, glutaraldehyd, och osmium grundämnetetroxide skapa intermolekylär och intramolekylära tvärbindning mellan makromolekyler i vävnaderna, vilket ger utmärkt bevarande av Ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiska prover är känsliga för temperatur. Temperaturen i början av fixering rekommenderas att vara 4 ° c för att minska den laterala rörligheten för membranproteiner, att bromsa spridningen av intercellulära molekyler, och att bromsa graden av fixering11. Den tid som krävs för att fästa vävnader beror till stor del på provets storlek och den hastighet med vilken fixativ sprider sig och reagerar med komponenterna i preparatet. En övernattning fixering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS vid 4 ° c är den föredragna metoden för SEM analys av prover som används i denna studie för deras sekventiella penetrerande egenskaper, som gör att mindre känsliga prover som skall bearbetas17 , 18 , 19 , 20 , 27. en post-fixering steg med osmium grundämnetetroxide elimineras inte bara på grund av dess giftiga natur utan också funnit att genomföra ingen extra fördel att förbättra bildkvaliteten för de prover som analyseras i denna studie.
Biologiska prover innehåller vätskor som stör SEM-operationen; Proverna måste därför torkas innan de sätts in i SEM-provkammaren. När dehydratisering säkerställs, måste lösningsmedlet avlägsnas från vävnaden utan att skapa artefakter i proverna på grund av ytspänningen/torkning. Tre olika torkmetoder användes vanligen vid bearbetning av vävnader för SEM-avbildning: lufttorkning, kritisk punkt torkning och frys tork prov28,29,30,31. Få studier rapporterar alla tre torkmetoder som producerar identiska resultat med djurvävnadsprover28,29,30,31. En allmän praxis som används för mindre exemplar är kemisk uttorkning genom stigande koncentration serie av alkohol och hexamethyldisilazane (HMDS), men större prover torkas med hjälp av en kritisk punkt torkning (CPD) instrument32. Under torkningsprocessen, stora krafter bildas i små hålrum som leds genom provet genom en vätska/gas gränssnitt; Detta kan även leda till en fullständig kollaps av de ihåliga strukturerna33. Deformationer som uppstår på grund av behandlingen kan då förväxlas med en ursprunglig strukturell egenskap hos preparatet. Således bör det generaliserade fenomenet för bearbetning elimineras och en unik torkprocess bör standardiseras för varje typ av vävnad, särskilt när känsliga vävnadsprov analyseras.
I flera prövningar som utförs med hjälp av olika kombination av alla ovan nämnda processer, standardiserade vi de metoder som kan användas för SEM analys av tre känsliga vävnader: reptil embryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer. Utvecklingbiologer och morfologer beskriver normala och onormala morfogenes under embryots utveckling hos representativa ryggradsdjur. Utredningar om gen signalvägar beror på den morfologiska beskrivningen av nya strukturer. För att undvika plötsliga förändringar av ryggradsdjur embryot under SEM-analys, rekommenderar vi kemisk torkning efter uttorkning. Kemisk torkning med HMDS är den relativt nyaste tork metoden och fördelarna inkluderar relativ snabbhet, användarvänlighet, förlorad kostnad, och den begränsade expertis och utrustning som behövs9. CPD är en vanligt förekommande torkteknik med hjälp av passaging CO2 över proverna vid en viss temperatur och tryck. Vi identifierade att HMDS är lämplig för torkning av mjuka känsliga vävnader och tillåter större prover som skall bearbetas jämfört med kritisk punkt torkning, vilket orsakade omfattande deformation till embryonala vävnader. Flera metoder har använts för att förbereda prover för SEM Imaging att studera de morfologiska egenskaperna hos svampar34. Svampprover är vanligen fasta i osmium tetroxid följt av etanol uttorkning och kritisk punkt torkning, som kan ge tillfredsställande resultat, även om de toxiska effekterna av osmium grundämnetetroxide6,7,35 och förlora svamp material medan föränderliga lösningar under bearbetningen är uttalade nackdelar. Provet beredning teknik med hjälp av lufttorkning utan fixering har också praktiserats36 men resulterar i krympta och kollapsade strukturer, och observation av sådana prover kan lätt misstolkas medan karakterisera arten. Svamp hypha förlorar sin integritet i kontakt med vätskor och en jämn torkning kan inte uppnås för att återställa strukturen. På grund av denna effekt, frystorkning används ofta för torkning av mjuka vävnader som svamp mycel. Frystorkning fungerar bra för rena material men närvaron av eventuella salter eller sekretion kommer att skymma ytan detalj som kommer att identifieras endast på SEM visning skede. Vi kopplade bild kulturen metoden med glutaraldehyd fastställande och kritisk punkt torkning för att ge strukturella detaljer i intakt svamp hyfer och sporer. Även om CPD torkning orsakade krympning hos embryon, det resulterade i väl bevarade Mycelial strukturer när den kombineras med glutaraldehydfixering. Äggskal är av primär betydelse för embryot till oviparous djur genom att inte bara fungera som en skyddande beläggning utan också att ge mekanisk stabilitet, permeabilitet för gas och vatten, och en kalcium reserv för att utveckla embryot. Sötvatten sköldpadda äggskal klassificeras som "stela" baserat på deras struktur, och på grund av deras tillgänglighet har fått betydande uppmärksamhet från biologer1,2,3,4 , ,5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Vi detalj enkla metoder för enkel undersökning av äggskal och skal membran av målade sköldpadda som kan tillämpas på alla stela äggskal arter. Beredningsmetoder utvärderades baserat på resulterande bildkvalitet och minskad potentiella artefakter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Även om scanning elektronmikroskopi (SEM) används i stor utsträckning för den ultrakonstrukturella analysen av olika biologiska och icke-biologiska prover, innebär metoder involverade i bearbetning av olika biologiska prover unika metoder. Alla konventionella metoder som beskrivs i litteraturen för bearbetning prover fortfarande hitta användbara program, men subtila förändringar i provet preparatet kan förändra bildkvaliteten, samt införa artefakter. Därför, med hjälp av en unik provberedning teknik som är specifika för den typ av vävnad analyseras krävs för att få en god kvalitet bild med ultrastrukturella upplösning. Fokus för denna studie är att ge optimala provberedning protokoll för Imaging embryon, stela äggskal, och svamp kulturer med SEM. Följande optimeringar rekommenderades att ge goda resultat för de tre olika känsliga biologiska prover studeras. Användning av mildare fixeringsmedel som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd följt av uttorkning med etanol serien är obligatoriskt. Svamp mycel på agar block som erhålls genom bild kulturer ger en bättre ultrastrukturella integritet jämfört med kulturer tagna direkt från agar plattor. Kemisk torkning av embryon med HMDS ger torkning utan att införa ytspännings artefakter jämfört med kritisk punkt torkning. HMDS förhindrar sprickbildning orsakad av krympning eftersom proverna är mindre spröda under torkning. Men för svamp kultur, kritisk punkt torkning ger acceptabel bildkvalitet jämfört med kemisk torkning. Äggskal kan avbildas utan särskild förberedelsesteg förutom grundlig tvättning och lufttorkning före montering. Berednings metoderna standardiserades utifrån godtagbar bildkvalitet som erhållits vid varje försök.

Figur 1 Visa skanning elektron Mikrografisk analys av målade sköldpadda (Chrysemys picta) embryon. Målade sköldpadda ägg samlas in och inkuberas på ett strö medium, monterad på aluminium-stubbar efter kemisk torkning användes för SEM-avbildning (figur 1a-E). En lateral bild av en etapp 12 embryo visar kraniofacial strukturer; maxillary framträdande sträcker sig bortom mandibular och begränsar en väl markerad nasal grop med...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Bearbetning embryo, äggskal, och svamp kultur för scanning elektronmikroskopi

Här presenterar vi detaljerade bearbetnings protokoll för avbildning av känsliga vävnadsprov med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM). Tre olika bearbetningsmetoder, nämligen, hexametyldisilazana (HMDS) kemisk torkning, enkel lufttorkning, och kritisk punkt torkning beskrivs för beredning av styv äggskal, embryon i tidiga utvecklingsstadier, och svamp kulturer respektive.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Vi har standardiserade protokoll prov förberedelse för imaging målade sköldpadda embryon, styva äggskal och svamp kulturer med hjälp av scanning elektronmikroskopi. Dessa omfattande metoder använder subtila ändringar till kända protokoll för att bearbeta tre känsliga vävnader gör det möjligt att differentiera mellan ursprungliga strukturer och bearbetning av artefakter. Demonstrera förfarandet med mig kommer att Jessica Gibbons, en doktorand från mitt laboratorium.Innan du samlar sköldpaddsägg från en fältplats under häckningssäsongen, gör fyra till sex 0,25 centimeters hål längs sidorna av plastlådor och på deras lock för att tillåta avering. Innan du fyller lådorna med en fuktig blandning av vermikulit och torv mossströning blandning vid en en till ett förhållande. Vid boplatsen, försiktigt ta bort jorden för att avslöja äggen och torka ytan av varje sköldpaddsägg med en utspädd jod tinktur för att skydda mot mikrobiell kontaminering under inkubation.Placera högst åtta till nio ägg per låda i samma orientering och inriktning som de lades, hålla enskilda kopplingar separat från varandra. När alla ägg har samlats in, manuellt begrava äggen hälften i sängkläder och placera lidded lådor inuti en 30 grader Celsius inkubator i 10 till 17 dagar för att få embryonala stadier 12, 13 och 18 embryon respektive. Tillsätt destillerat vatten för att delvis blöta strömediet varannan dag för att undvika uttorkning, och för att upprätthålla fuktnivån för normal embryoutveckling.Vid lämpligt utvecklingsstadium, använd spetsig sax för att göra ett snitt på ena sidan av ryggäggskal och äggula membran tillsammans, vertikal till den långa axeln av ägget. Därefter skär den andra sidan av ägget längs den korta axeln, och använd tång för att skala öppna den strukna biten med embryosidan uppåt. Skär den andra laterala sidan av äggskal och placera strukits bit skal i PBS.Med hjälp av ett stereomikroskop och tuppar, skala embryot och äggula membran från äggskal. Använd tlyktorna och mikrosaxen för att ta bort de extra embryonala membranen och använd en embryosked för att överföra embryot till en petriskål med färsk PBS. Efter tvättning bort blod och äggula, placera upp till tre embryon per brunn av en 12-brunns tallrik, som innehåller 4%paraformaldehyd vid fyra grader Celsius i två till tre dagar.När proverna visas vita, använd polystyreninsatser med polyesternätbottnar för att skölja embryona med tre fem minuters tvättar i färsk PBS per tvätt. Efter den sista tvätten, torka prover i en stigande etanol serie för en timme per koncentration. Efter den andra etanol nedsänkning, torka embryon i en serie HMDS till etanol koncentrationer i 20 minuter per nedsänkning med Petri-diskarna delvis omfattas.Placera sedan embryona i en slutlig 100%HMDS-lösning, helt eller delvis täckt i en rökhuva över natten. Långsam torkning genom att gradvis öka koncentrationen av HDMS till etanol är viktigt för att avslöja en utmärkt ytstruktur i embryona. Nästa morgon, använd dubbel pinne kol ledande tejp för att noggrant montera de helt torkade proverna på en vanlig aluminium stift stub.När alla prover har monterats, införa proverna i sputter coater kammaren att belägga exemplaren med en mycket tunn film av guld i 60 till 120 sekunder på en 35 milliamp sputter. Fäst sedan ordentligt setskruvarna för att montera stubbarna på motsvarande hällplattor. Använd provbytesverktyget för att överföra provhållaren till provkammaren på svepelektronmikroskopet för avbildning.För att förbereda äggskal för skanning elektronmikroskopi, placera äggskal i destillerat vatten i minst en timme efter embryoskörden för att eliminera alla äggula eller albumin kontaminering. Därefter lufttorkar de rengjorda äggskalen på känsliga anti-statiska våtservetter i rökhuven över natten. Förvara de torkade äggskalen i rena provflaskor, märkta med nummer och embryostadium.Sedan montera, sputter päls och bild äggskal exemplar som bara visat för embryon. För att etablera glid svampkulturer, använd en steril skalpell för att skära halv till tre kvarts tum block av fast potatis dextros agar, och placera blocken på enskilda glas mikroskop diabilder. Placera sterila tandpetare på botten av rena Petri-rätter för att höja glidbanor bort av dem för att skapa ytspänning mellan plattan och bilden.Placera varje bild på tandpetare i Petri-skålen. Därefter använder en steril slinga för att överföra svampar från provet inokulat till var och en av de fyra laterala sidorna av ett agarblock. Tillsätt några droppar sterilt destillerat vatten till petriskålen runt rutschkanan för att säkerställa fukt för de växande svamparna.Delvis försegla plattan med paraffin film och placera plattan i 30 grader Celsius inkubator för lämplig inkubationstid för svamparter. I slutet av inkubationen, ta bort bilden från Petriskålen och använd sterila trikåer för att överföra tätt följsam agarblocket från bilden till en behållare med 3%glutaraldehyd för en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, torka proverna i en stigande etanol serie i 15 minuter per koncentration.Efter 90%-nedsänkningen, bearbeta proverna för slutlig uttorkning med två 30 minuters förändringar i 100%etanol för att säkerställa en fullständig mättnad innan de uttorkade proverna placeras i kammaren i den kritiska punkten torkapparat. Försegla kammaren och öppna ventilerna för att låta flytande koldioxid att ventilera in och att låta etanol ventilera ut tills flytande koldioxid helt fyller kammaren. Därefter försegla och långsamt värma kammaren för att uppnå en kritisk punkt när kammaren trycket överstiger 1, 000 pounds av tryck per kvadrattum, temperaturen överstiger 31 grader Celsius, och vätska och gas utrymme av koldioxid är i jämvikt.Sedan långsamt dränera koldioxid från kammaren och provet som en gas, för att undvika eventuella effekter av ytspänning på provet, och montera, platta och bild svamp exemplar som visas. En lateral scanning elektron mikrograf bild av en etapp 12 målade sköldpadda embryo avslöjar hur maxillary framträdande sträcker sig bortom mandibular och mediaially begränsar en väl markerad nasal grop. Fem faryngeal valv kan också observeras.I ett steg 15 embryo, nybildade somiter är synliga på den bakre svansen regionen av embryot, och framben knoppar pekar mer kortal än ventrally. En väldefinierad utväxt av en ryggsköld ås kan också visualiseras längs hela interlimb flanken regionen av embryot. I steg 18 har en kort svagt utskrivd nos bildats med en något uppskruvad nedre näbb med en terminalkrok som passar in i den övre näbbens centrala skåra.Överkäken uppvisar ett skårat utseende, och en liten äggtand kan ses bildas på överkäken. Ultrastructural analys av Chrysemys picta äggskal och skal membran genom att skanna elektronmikroskopi, avslöjar en yttre calcarinus äggskal lager, fast fäst vid den inre fintrådiga skal membran. Äggskalets yttre yta består av väl framstående mineraliserade skalenheter tillverkade av klotformiga sfäriska härdarna som är ordnade i grupp och däremellan angränsande skalenheter, med en koncentration av små rundade fördjupningar eller porer av olika storlekar.Vanliga metoder kan inte generaliseras för alla biologiska exemplar för att uppnå en anständig bildkvalitet med hjälp av SEM. Unika ändringar som visats är väsentliga för en specifik vävnadstyper. Den kemiska och lufttorkningsmetoden skulle också kunna användas för andra organiska prover, och kopplingsdymparodlingstekniken skulle kunna användas för alla mjuka, robusta mikrobiella kulturer.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodal optisk mikroskopi Metoder Reveal Polyp vävnadsmorfologi och Struktur i Karibien Reef Building Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Data Processing metoder för 3D seismik avbildning av markytan vulkaner: program till den Tarim översvämning basalten

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal skanning Conductometry (TSC) som en allmän metod för att studera och styra beteendet fas av konduktiv fysiska geler

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Samling och utvinning av yrkesmässig luftprover för analys av svamp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Hög genomströmning, hur provtagningsutrustningen skall protokollet för analys av bearbetning parametrar och näringsvärde i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionell (3D)-tryckt mall för hög genomströmning zebrafiskar Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem vatten distribution i Woody växter visualiseras med en Cryo-scanning Electron Mikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Provberedningmetod för skanning och transmissionselektronmikroskop för bihang av träsborre

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...