Name: processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego yararlı tartışmalar ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Rice Creek Associate Grants, Oswego tarafından desteklenmiştir; Challenge Grants SUNY Oswego ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) PGL ve JG için Küçük Hibeler.

NOT: Bu çalışmada kullanılan boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta)yumurtaları Mayıs-Haziran 2015-16 yılları arasında New York Çevre Bakanlığı'ndan alınan izinle Oswego New York'taki Rice Creek Saha İstasyonu'ndan toplanmıştır. Koruma (DEC).
1. SEM için embriyoları işlemek için kimyasal kurutma yöntemi
<ol><li>Yuvalama mevsiminde tarla sitelerinden kaplumbağa yumurtaları toplayın. Kapaklı plastik kutulardan (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm dolgulu yem ...

Çalışmamızda sem görüntüleme için üç farklı hassas biyolojik örnek hazırlamak için farklı fiksasyon ajanları, dehidratasyon ve kurutma yöntemleri test edilmiştir: embriyolar, yumurta kabukları ve mantar kültürleri. SEM genellikle yüzey analizi için kullanılır, bu nedenle fiksatif penetrasyon daha az endişe vericidir, ancak kötü sabit iç yapıların içe doğru küçülmeye veya/ve çökmüş yüzey yapılarına neden olacağı anlaşılmalıdır. Daha büyük doku örnekleri için de uzun fik...

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ultrastrüktürel analizi ve hücre içi görüntüleme prokaryotların, bitkilerin ve hayvanların üç boyutlu profilini çıkarmak için ışık mikroskobunu tamamlar. Bir SEM'nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, onu nanometreden mikrometre ölçeğine kadar numunelerin mikroyapısal özelliklerinin incelenmesi için mevcut olan en çok yönlü ve güçlü tekniklerden biri haline getirir. Kurutulmuş numuneler, fonksiyonel ilişkiler hakkında geçerli sonuçlar geliştirmenin temelini oluşturan, yoğun ayrıntılarla kompozisyon ve topografik yapılara çözülür1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9- Biyolojik örneklerin SEM görüntüleri yorumlarken, doğal yapılar ve işleme sırasında oluşturulan eserler arasında ayrım yapmak büyük bir meydan okumadır. SEM genellikle örnek10,11yayılan birincil, ikincil veya geri dağınık elektron ışınları etkileyen gaz molekülleri herhangi bir girişim önlemek için çok yüksek vakumlar çalıştırılır. Ayrıca, biyolojik maddeler kötü veya iletken olmayan özellikleri nedeniyle radyasyon hasarına duyarlıdır. Sem'e yüklenen numunelerin tamamen kuru ve organik kirletici maddelerden arındırılmış olması ve yüksek vakum ortamında gazgiderme olasılığına karşı 10,11. Biyolojik numuneler çoğunlukla sudan oluştuğu için, yerli yapıların korunmasını sağlamak için ek preparatif teknikler gereklidir.
Elde edilen çözünürlük, numune tiplerine ve kullanılan enstrümental parametrelere özgü hazırlama yöntemlerinin optimize edilmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, tüm doku tipleri için genelleştirilmiş işleme adımları kullanmaktan kaçınmak gerekir. Bazı biyolojik numuneler yapılarını korumak için daha az sıkı işleme gerektirirken, büzülme ve çökme gibi kurutma eserlerinin piyasaya sürülmesini önlemek için hassas numune türleri için daha fazla zaman ve bakım gerekebilir. Örnek hazırlama SEM görüntülemede kritik bir adımdır; morfometrik çalışmaların bulguları örnek hazırlama prosedürleri12,13tarafından belirgin bir şekilde etkilenmiştir. Birçok biyolojik numune için ortak hazırlık adımları, yüzeylerini SEM analizi için iletken olarak dönüştürmek için altın, platin veya paladyum gibi bir metalle fiksasyon, dehidratasyon ve kaplamadır. Kullanılan adımların niteliği ve kombinasyonu dokunun türüne ve çalışmanın özel hedeflerine bağlı olarak değişir. Şarj birikmesi, vakum ve elektron ışını hasarına duyarlılık yumuşak hassas biyolojik numuneleri işlerken sorun teşkil ederek nesnenin doğal yapısını korumak için ek işleme adımları gerektirir. Osmiyum tetroksit sabitleme gibi konvansiyonel yöntemler kullanarak, ve dehidratasyon büzülme ve hassas dokuların çöküşüneden14,15,16,17. Çalışmanın amacı, yumuşak hassas dokuları (örneğin, sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabuğu ve mantar kültürleri) hazırlamak ve imajlandırmak için yapılan değişikliklerle önceki çalışmalardan elde edilen fikirleri birleştirerek elde edilen zarif metodolojiler oluşturmaktır.
Uygun bir sabitleme yönteminin seçilmesi biyolojik örneklerin mikroskobik analizi için ilk önemli adımdır. Bir organizmadan izole sonra hemen dokuların düzeltilmesi çürümeye bağlı morfolojilerinde değişimi önlemek için gereklidir. Etkili bir fiksatif, hücreleri hızlı bir şekilde etkileyerek ve numunenin yapısını stabilize etmek için etkisini geri dönülmez bir şekilde koruyarak hücresel süreçleri sona erdirmeli ve hem sonraki işlem adımlarına hem de SEM17 altında incelemeye dayanmalıdır. , 18. Çeşitli kimyasal ve fiziksel fiksasyon yöntemleri bilinmesine rağmen, kimyasal fiksasyon daha yaygın biyolojik örnekler için otoliz, putrefaction ve kurutma etkileri nedeniyle herhangi bir hücresel değişiklikleri önlemek için kullanılır. Literatürde tartışılan çok sayıda fiksatif kimyasal formülasyonlar vardır17,19,20,21,22,23, denaturing tarafından çalışmak fiksatifler ve biyolojik makromoleküllerin pıhtılaşma, ve kovalent çapraz-bağlantı makromoleküller tarafından düzeltmek olanlar. Alkoller ultrayapıyı çok kötü koruyan ve çoğunlukla ışık mikroskobu için kullanılan ve elektron mikroskobik analizi için tavsiye edilmeyen denaturing fiksatifler olarak kullanılır. Formaldehit, glutaraldehit ve osmium tetroksit gibi çapraz bağlantı fiksatifler dokular içindeki makromoleküller arasında moleküler ve intramoleküler çapraz bağlantı oluşturarak ultra yapıların mükemmel korunmasını sağlar11 ,24,25,26. Biyolojik numuneler sıcaklığa duyarlıdır. Fiksasyon başında sıcaklık membran proteinlerinin yanal hareketliliğini azaltmak için 4 °C olması tavsiye edilir, hücreler arası moleküllerin difüzyonunu yavaşlatmak için, ve fiksasyon hızını yavaşlatmak için11. Dokuların düzeltilmesi için gereken süre büyük ölçüde numunenin boyutuna ve fiksatif in numunenin bileşenleriyle birlikte yayıldığı ve tepki verdiği hıza bağlıdır. 4 °C'de PBS'de %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit de bir gecede fiksasyon, bu çalışmada kullanılan örneklerin sıralı penetratif özellikleri açısından SEM analizi nde tercih edilen yöntemdir ve daha küçük hassas numunelerin işlenmesine olanak sağlar17 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 27- Osmiyum tetroksit ile bir fiksasyon sonrası adım sadece toksik doğası nedeniyle ortadan kaldırılır ama aynı zamanda bu çalışmada analiz örnekleri için görüntü kalitesini artırmak için hiçbir ek avantaj uygulamak bulundu.
Biyolojik numuneler SEM işlemini engelleyen sıvılar içerir; bu nedenle, örneklerin SEM numune odasına yerleştirilmeden önce kurutulması gerekir. Dehidratasyon sağlandıktan sonra, yüzey gerilimi/kuruma nedeniyle numunelere objeler oluşturulmadan çözücü dokudan uzaklaştırılmalıdır. Üç farklı kurutma yöntemleri yaygın SEM görüntüleme için dokuların işlenmesi sırasında kullanılmıştır: hava kurutma, kritik nokta kurutma, ve dondurma kurutma örnekleri28,29,30,31. Birkaç çalışma hayvan dokusu örnekleri28,29,30,31ile aynı sonuçları üreten üç kurutma yöntemleri rapor. Daha küçük numuneler için kullanılan genel bir uygulama alkol ve hexamethyldisilazane konsantrasyon serisi artan kimyasal dehidratasyon vardır (HMDS), ancak daha büyük örnekler kritik bir nokta kurutma kullanılarak kurutulur (CPD) alet32. Kurutma işlemi sırasında, numuneden sıvı/gaz arabirimi ile geçen küçük boşluklarda oluşan önemli kuvvetler; bu bile içi boş yapıların tam bir çöküşüne yol açabilir33. Tedavi nedeniyle meydana gelen herhangi bir deformasyon daha sonra numunenin doğal yapısal bir özelliği olarak yanlış olabilir. Bu nedenle, işleme için genelleştirilmiş fenomen ortadan kaldırılmalı ve özellikle hassas doku örnekleri analiz edildiğinde her doku tipi için benzersiz bir kurutma işlemi standartlaştırılmalıdır.
Yukarıda bahsedilen tüm süreçlerin çeşitli kombinasyonu kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalarda, üç hassas dokuların SEM analizi için kullanılabilecek yöntemleri standartlaştırdık: sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabukları ve mantar kültürleri. Gelişimbiyologları ve morfolojistler temsili omurgalı hayvanlarda embriyo gelişimi sırasında normal ve anormal morfogenezi tanımlarlar. Gen sinyal yolları üzerinde yapılan araştırmalar yeni yapıların morfolojik tanımına bağlıdır. SEM analizi sırasında omurgalı embriyo yapısında ani bir değişiklik olmasını önlemek için, dehidratasyon sonrası kimyasal kuruma öneririz. HMDS kullanarak kimyasal kurutma nispeten yeni kurutma yöntemi dir ve avantajları göreceli çabukluk, kullanım kolaylığı, kayıp maliyet ve sınırlı uzmanlık ve ekipman9gerekli içerir. CPD, numuneler arasında belirli bir sıcaklık ve basınçta paslama CO2 kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir kurutma tekniğidir. HMDS'nin yumuşak hassas dokuların kurutulması için uygun olduğunu ve embriyonik dokularda kapsamlı deformasyona neden olan kritik nokta kurumasına göre daha büyük numunelerin işlenmesine olanak sağladığını belirledik. Mantarların morfolojik özelliklerini incelemek için SEM görüntüleme için örnekler hazırlamak için çeşitli yöntemler kullanılmıştır34. Mantar örnekleri genellikle osmiyum tetroksit etanol dehidratasyon ve kritik nokta kurutma takip sabittir, hangi tatmin edici sonuçlar sağlayabilir,osmiyum tetroksit toksik etkileri 6 rağmen,7,35 ve işleme sırasında çözelti değiştirirken mantar malzemelerini kaybetme dezavantajları belirgindir. Fiksasyon olmadan hava kurutma tekniği de uygulanmıştır36, ancak küçülmüş ve çökmüş yapılarla sonuçlanmıştır ve bu tür örneklerin gözlemi, türleri karakterize ederken kolayca yanlış yorumlanabilir. Mantar hypha sıvılar ile temas bütünlüğünü kaybeder ve hatta kurutma yapısı geri elde olmayabilir. Bu etki nedeniyle, donma-kurutma genellikle mantar misel gibi yumuşak dokuların kurutma için kullanılır. Dondurma kurutma temiz malzemeler için iyi çalışır ancak herhangi bir tuz veya salgı varlığı sadece SEM görüntüleme aşamasında tespit edilecek yüzey detay belirsiz olacaktır. Biz bozulmamış mantar hyphae ve sporların yapısal detayları verim için glutaraldehit sabitleme ve kritik nokta kurutma ile slayt kültür yöntemi birleştiğinde. CPD kurutma embriyolarda büzülme neden olmasına rağmen, glutaraldehit fiksasyonu ile birleştiğinde iyi korunmuş misel yapıları sonuçlandı. Yumurta kabuğu sadece koruyucu bir kaplama olarak hareket değil, aynı zamanda mekanik istikrar, gaz ve su geçirgenliği ve gelişmekte olan embriyo için bir kalsiyum rezervi sağlayarak oviparous hayvanların embriyo için birincil önemtaşımaktadır. Tatlı su kaplumbağası yumurta kabukları kendi yapısına göre "sert" olarak sınıflandırılır veonların durumu nedeniyle biyologlar 1,2,3,4 önemli ilgi almış , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 37.000 , 38'e kadar.
Biz herhangi bir sert yumurta kabuğu türlerine uygulanabilir boyalı kaplumbağa yumurta kabuğu ve kabuk membranlar kolay incelenmesi için basit yöntemler detay. Hazırlık metodolojileri, ortaya çıkan görüntü kalitesi ve azaltılmış potansiyel eserlere göre değerlendirildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="711">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agar</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S25127A</td>
			<td style="width:229px;">for slide cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pin stub</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">16111</td>
			<td style="width:229px;">12.7 mm x 8 mm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD 213400</td>
			<td style="width:145px;">DF0013-17-6</td>
			<td style="width:229px;">Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer BioReagents</td>
			<td style="width:145px;">BP904-100</td>
			<td style="width:229px;">Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coarse Vermiculite</td>
			<td style="width:123px;">Greenhouse Megastore</td>
			<td style="width:145px;">SO-VER-12</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Clear 12- well plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">07-201-589</td>
			<td style="width:229px;">for fixing embryo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S17525B</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:123px;">Quorum CPD</td>
			<td style="width:145px;">EMS850</td>
			<td style="width:229px;">critical point drying</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Culture dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08 747B</td>
			<td style="width:229px;">DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A406P 4</td>
			<td style="width:229px;">dehydration agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Forceps- Aquarius Tweezers</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5804</td>
			<td style="width:229px;">style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">G151-1</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Gold target for sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">TAR001-0158</td>
			<td style="width:229px;">Gold Target, 2.375&#8243; D X .002&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hexamethyldisilazana</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">C19479-5000</td>
			<td style="width:229px;">chemical drying agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Kim wipes</td>
			<td style="width:123px;">Kimtech</td>
			<td style="width:145px;">S-8115</td>
			<td style="width:229px;">cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">67-762-16</td>
			<td style="width:229px;">for slide culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscopy Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1327</td>
			<td style="width:229px;">Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8&#34;).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">1346</td>
			<td style="width:229px;">Vannas-type, straight, 80mm L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Moria Perforated Embryo Spoon</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10370-17</td>
			<td style="width:229px;">Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Netwell Inserts</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">0330B09</td>
			<td style="width:229px;">15 mm Inserts with 74 &#181;m Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:145px;">T353 500</td>
			<td style="width:229px;">fixative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Peat moss</td>
			<td style="width:123px;">Walmart- Miracle Gro</td>
			<td style="width:145px;">551705263</td>
			<td style="width:229px;">bedding medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">PELCO tabs double stick carbon conductive tape</td>
			<td style="width:123px;">Tedpella</td>
			<td style="width:145px;">5000</td>
			<td style="width:229px;">12 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:123px;">DENTON VACUUM</td>
			<td style="width:145px;">DESK V</td>
			<td style="width:229px;">thin metal coating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">SEM</td>
			<td style="width:123px;">JEOL USA</td>
			<td style="width:145px;">JEOL JSM 6610LV scanning electron scope</td>
			<td style="width:229px;">electron microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) çeşitli biyolojik ve biyolojik olmayan numunelerin ultra-yapısal analizinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, farklı biyolojik numunelerin işlenmesinde kullanılan yöntemler benzersiz uygulamalar içerir. Örneklerin işlenmesi için literatürde açıklanan tüm geleneksel uygulamalar hala yararlı uygulamalar bulmak, ancak örnek hazırlama ince değişiklikler görüntü kalitesini değiştirebilir, hem de, eserler tanıtmak. Bu nedenle, analiz edilen doku tipine özgü benzersiz bir numune hazırlama tekniği nin kullanılması, ultrayapısal çözünürlüğe sahip kaliteli bir görüntü elde etmek için gereklidir. Bu çalışmanın odak noktası SEM kullanarak embriyolar, sert yumurta kabukları ve mantar kültürleri görüntüleme için en uygun örnek hazırlama protokolleri sağlamaktır. İncelenen üç farklı hassas biyolojik örnek için iyi sonuçlar vermek için aşağıdaki optimizasyonlar önerildi. %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit ve ardından etanol serisi ile dehidratasyon gibi daha hafif fiksatiflerin kullanılması zorunludur. Slayt kültürleri tarafından elde edilen agar bloklar üzerindeki mantar miseli, doğrudan agar plakalarından alınan kültürlere göre daha iyi bir ultrayapısal bütünlük sağlar. HMDS ile embriyoların kimyasal olarak kurutulması, kritik nokta kurutmasına kıyasla yüzey gerilimi objeleri kullanılmadan kurutulmasını sağlar. HMDS, numuneler kurutma sırasında daha az kırılgan olduğundan büzülmenin neden olduğu çatlamaları önler. Ancak, mantar kültürü için, kritik nokta kurutma kimyasal kurutma ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir görüntü kalitesi sağlar. Yumurta kabukları montajdan önce iyice yıkama ve hava kurutma dışında özel bir hazırlık adımı olmadan görüntülenebilir. Hazırlama metodolojileri, her denemede elde edilen kabul edilebilir görüntü kalitesine göre standartlaştırılmıştır.

Şekil 1, boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta) embriyolarının taramalı elektron mikrografik analizini göstermektedir. Kimyasal kuruduktan sonra alüminyum saplara monte edilen bir yatak makinesinde toplanan ve kuluçkaya yatan boyalı kaplumbağa yumurtaları SEM görüntüleme için kullanılmıştır (Şekil 1A-E). Evre 12 embriyonun yanal görünümü kraniyofasiyal yapıları gösterir; maksiller önem mandibular ötesine uzanı...

Watch this Scientific Journal Video about Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak boyalı kaplumbağa embriyolarının, sert yumurta kabuklarının ve mantar kültürlerinin görüntülenmesi için standart örnek hazırlama protokollerimiz bulunmaktadır. Bu kapsamlı yöntemler, orijinal yapılar ve eserler işleme arasındaki ayrım sağlayan üç hassas dokuları işlemek için bilinen protokollerde ince değişiklikler kullanın. Prosedürü benimle birlikte göstermek Jessica Gibbons olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi.Yuvalama mevsiminde bir tarla dan kaplumbağa yumurtatoplamadan önce, havalandırma izin vermek için plastik kutuların kenarları ve kapakları boyunca dört ila altı 0,25 santimetre delik yapmak. Vermikülit ve turba yosun yatak karışımı nemli bir karışımı ile kutuları doldurmadan önce bir oran bir. Yuvalama yerinde, yavaşça yumurta ortaya çıkarmak için toprak kaldırmak ve kuluçka sırasında mikrobiyal kontaminasyona karşı korumak için seyreltilmiş iyot tentürü ile her kaplumbağa yumurta yüzeyini silmek.Kutu başına en fazla sekiz ila dokuz yumurtayı, tek tek debriyajları birbirinden ayrı tutarak, yatırıldığı gibi aynı oryantasyon ve hizada yerleştirin. Tüm yumurtalar toplandığında, yumurtaların yarısını yatak takımlarına elle gömün ve kapaklı kutuları sırasıyla 12, 13 ve 18 embriyoyu elde etmek için 10 ila 17 gün boyunca 30 derecelik bir kantinin içine yerleştirin. Dehidratasyon önlemek için yatak ortamı nı kısmen ıslatmak ve normal embriyo gelişimi için nem seviyesini korumak için damıtılmış su ekleyin.Gelişimin uygun aşamasında, sırt yumurta kabuğu ve yumurta kabuğu nun bir tarafına bir kesim yapmak için sivri makası kullanın, yumurtanın uzun eksenine dikey. Daha sonra, kısa eksen boyunca yumurtanın diğer tarafını kesin ve embriyo tarafı yukarı ile excised parçası açmak soymak için çöyiş kullanın. Yumurta kabuğunun diğer yan tarafını kesin ve ekstremite parçasını PBS'ye yerleştirin.Bir stereomikroskop ve forceps kullanarak, yumurta kabuğundan embriyo ve sarısı membran soyma. Ekstra embriyonik membranlar kaldırmak için çömetüler ve mikro makas kullanın ve taze PBS bir Petri kabına embriyo aktarmak için bir embriyo kaşığı kullanın. Herhangi bir kan ve sarısı yıkadıktan sonra, iki ila üç gün boyunca dört derece santigrat% 4 paraformaldehit içeren, 12-iyi plaka iyi başına üç embriyo kadar yerleştirin.Örnekler beyaz göründüğünde, yıkama başına taze PBS üç beş dakika yıkar ile embriyoları durulayın polyester örgü dipleri ile polistiren ekler kullanın. Son yıkamadan sonra, konsantrasyon başına bir saat boyunca artan bir etanol serisi örnekleri dehydrate. İkinci etanol daldırma sonra, petri yemekleri kısmen kaplı daldırma başına 20 dakika boyunca etanol konsantrasyonları için HMDS bir dizi embriyokuru.Sonra son bir 100% HMDS çözüm, tamamen veya kısmen bir duman başlık bir gecede kaplı embriyolar yerleştirin. HDMS konsantrasyonunu yavaş yavaş etanole artırarak yavaş kurutma, embriyolarda mükemmel bir yüzey yapısını ortaya çıkarmak için önemlidir. Ertesi sabah, tamamen kurutulmuş numuneleri standart alüminyum pim sapına dikkatlice monte etmek için çift çubukkarbon iletken bant kullanın.Tüm numuneler monte edildiğinde, numuneleri 35 miliamperlik bir fışkırtmaya 60 ila 120 saniye boyunca çok ince bir altın filmi ile kaplamak için püskürtme kaplama odasına tanıtınız. Daha sonra, saplamaları ilgili dökme plakalarına monte etmek için set vidalarını güvenli bir şekilde sabitle. Örnek tutucuyu görüntüleme için taramalı elektron mikroskobunun örnek odasına aktarmak için örnek değişim aracını kullanın.Taramalı elektron mikroskobu için yumurta kabukları hazırlamak için, herhangi bir sarısı veya albumin kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için embriyo hasadından sonra en az bir saat boyunca yumurta kabuklarını distile suya yerleştirin. Daha sonra, hava duman kaputunda hassas anti-statik mendiller üzerinde bir gecede temizlenmiş yumurta kabukları kuru. Kurutulmuş yumurta kabuklarını sayı ve embriyo aşamasına göre etiketlenmiş temiz numune şişelerinde saklayın.Daha sonra, montaj, sputter ceket ve görüntü yumurta kabuğu örnekleri gibi sadece embriyolar için gösterdi. Slayt mantar kültürleri kurmak için, katı patates dekstroz agar yarım çeyrek inç blok kesmek için steril bir neşter kullanın ve tek tek cam mikroskop slaytlar üzerine blokları yerleştirin. Plaka ve slayt arasında yüzey gerilimi oluşturmak için onlardan slaytlar yükseltmek için temiz Petri yemeklerinin altına steril kürdan yerleştirin.Petri çanak kürdan her slayt yerleştirin. Daha sonra, bir agar bloğunun dört yan tarafının her birine örnek inoculum mantarları aktarmak için steril bir döngü kullanın. Büyüyen mantarlar için nem sağlamak için slayt etrafında Petri kabına steril distile su birkaç damla ekleyin.Plakayı kısmen parafin filmle kapatın ve mantar türleri için uygun kuluçka dönemi için plakayı 30 derece lik santigrat inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda, Petri kabından slayt kaldırmak ve dört derece santigrat bir gecede kuluçka için% 3 glutaraldehit bir konteyner için slayt sıkıca yapışmış agar blok aktarmak için steril forseps kullanın. Ertesi sabah, konsantrasyon başına 15 dakika boyunca artan bir etanol serisi örnekleri dehydrate.%90 daldırma işleminden sonra, kritik nokta kurutma cihazının haznesine susuz kalan numuneleri yerleştirmeden önce tam bir doygunluk sağlamak için %100 etanolte iki 30 dakikalık değişiklikle son dehidratasyon için numuneleri işleyin. Hazneyi kapatın ve sıvı karbondioksitin içeri girmesine izin vermek ve sıvı karbondioksit odayı tamamen doldurana kadar etanolün dışarı çıkmasına izin vermek için vanaları açın. Daha sonra, oda basıncı inç kare başına basınç 1,000 pound aştığında kritik bir noktaya ulaşmak için hazneyi yavaşça ısıtın, sıcaklık 31 santigrat dereceyi aşar ve karbondioksitin sıvı ve gaz boşluğu dengededir.Daha sonra, yüzey geriliminin numune üzerindeki herhangi bir etkisini önlemek için, depodaki karbondioksiti ve numuneyi gaz olarak yavaşça boşaltın ve mantar örneklerini gösterildiği gibi monte edin, plakalayın ve görüntüleyin. Bir aşama 12 boyalı kaplumbağa embriyoyanal tarama elektron mikrograf görünümü nasıl maksiller önem mandibular ötesine uzanır ve medially iyi işaretlenmiş burun çukuru sınırlar ortaya koymaktadır. Beş faringeal kemer de görülebilir.Evre 15 embriyoda, yeni oluşan somitler embriyonun arka kuyruk bölgesinde görülebilir ve ön ekstremite tomurcukları ventrally'den daha kortal işaret eder. Bir carapace sırt iyi tanımlanmış bir büyüme de embriyonun tüm interlimb kanat bölgesi boyunca görselleştirilmiş olabilir. 18. aşamada, kısa bir zayıf tahmin burun üst gaga merkezi çentik sığar bir terminal kanca ile biraz ters alt gaga ile oluşmuştur.Üst çene çentikli bir görünüm sergiler, ve küçük bir yumurta diş üst çene ucunda şekillendirme görülebilir. Elektron mikroskobu tarama ile Chrysemys picta yumurta kabuğu ve kabuk membran Ultrayapısal analizi, bir dış calcarinus yumurta kabuğu tabakası ortaya, sıkıca iç filamentöz kabuk membran bağlı. Yumurta kabuğunun dış yüzeyi, gruplar halinde ve bitişik kabuk üniteleri arasında düzenlenmiş küresel küresel nodüllerden yapılmış, küçük yuvarlak depresyonlar veya çeşitli boyutlarda gözeneklerin yoğunlaşmasıyla, iyi ayırt edilmiş mineralize kabuk ünitelerinden oluşur.SEM. Benzersiz değişiklikler belirli bir doku tipleri için gerekli olan sem. Kimyasal ve hava kurutma yöntemi diğer organik numuneler için de kullanılabilir ve bağlantı slayt kültür tekniği tüm yumuşak, sağlam mikrobiyal kültürler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Environment

Surface Renewal: An Advanced Micrometeorological Method for Measuring and Processing Field-Scale Energy Flux Density Data

Advanced micrometeorological methods have become  increasingly important in soil, crop, and environmental sciences.  For many scientists without formal ...

Çevre

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Data Processing Methods for 3D Seismic Imaging of Subsurface Volcanoes: Applications to the Tarim Flood Basalt

Yeraltı volkanlar 3D sismik görüntüleme için veri işleme yöntemleri: Tarım sel bazalt uygulamaları

The morphology and structure of plumbing systems can provide key information on the eruption rate and style of basalt lava fields. The most powerful way ...

Thermal Scanning Conductometry (TSC) as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Thermal Scanning Conductometry TSC as a General Method for Studying and Controlling the Phase Behavior of Conductive Physical Gels

Eğitim ve iletken fiziksel aşama davranışını denetlemek için bir genel yöntem jelleri gibi Conductometry (TSK) tarama termal

The thermal scanning conductometry protocol is a new approach in studying ionic gels based on low molecular weight gelators. The method is designed to ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Yüksek işlem hacmi, analiz işleme parametrelerini ve Mısır (Zea mays L.) beslenme nitelikleri için Microscale Protokolü

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Woodboring Böceği uzantıları için Tarama ve İletim Elektron Mikroskobu Örnek Hazırlama Yöntemi

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...