Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31600250، Y.Z.)، ومشاريع العلم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201804020015، H.N.)، ونظام البحوث الزراعية الصينية (رقم المنحة. CARS-04-PS09, H.N.).

1. التمهيدي التصميم 2.
<ol><li>تصميم التمهيديات الجينات محددة للنسخ العكسي (RT) باستخدام PCR التمهيدي تصميم البرمجيات (جدولالمواد)على أساس القواعد العامة للتصميم التمهيدي17. ملاحظة: التمهيديات RT هي محددة للغاية للنصوص المستهدفة، وأنها ترتكز عموما على الجزء 5 'من ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

في دراسة سابقة، تم استخدام مجموع وRNS الميتوكوندريا من ثقافة تعليق الخلايا من Arabidopsis لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني من قبل cRT-PCR، وتم الحصول على نتائج مماثلة12. ومع ذلك، تم استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب فقط لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني في العدي?...

في الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع العديد من RNAs ناضجة والسلائف كما isoforms متعددة، ويمكن تقسيم النصوص ثابت الدولة إلى مجموعتين على أساس الفرق في نهايات ها 5'1،2،3، 4. النصوص الأولية لها 5 'نهايات ثلاثي الفوسفات، والتي تستمد من بدء النسخ. وعلى النقيض من ذلك، فإن النصوص المجهزة تحتوي على 5'أحاديالفوسفات يتم إنشاؤها بواسطة المعالجة اللاحقة للنسخ. التمييز ورسم الخرائط من نوعين من النصوص مهمة لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء النسخ والانتهاء من النضج النص.
وللتمييز بين النصوص الأولية والنصوص المجهزة في المتن النباتي، وضعت أربع استراتيجيات رئيسية. وتتمثل الاستراتيجية الأولى في المعالجة المسبقة لمضادات الأوجاع الميتوكوندريا بحمض التبغ البيروففاتيز (TAP)، الذي يحول الفوسفات الثلاثي الفوسفات إلى الفوسفات الأحادي الفوسفات ويمكّن النصوص الأولية من التعميم بواسطة الليغاسي الحمض النووي الريبي. ثم تتم مقارنة وفرة النسخ من عينات الحمض النووي الريبي المعالجة وغير المعالجة عن طريق التضخيم السريع لنهايات cDNA (RACE) أو التعميم RT-PCR (cRT-PCR)2،3،4. في الاستراتيجية الثانية، يتم استنفاد النصوص المجهزة أولا من RNAs الميتوكوندريا باستخدام المنهي 5'-الفوسفات تعتمد exonuclease (تكس)، ثم يتم تعيين النصوص الأولية اليسار عن طريق تحليل التمديد التمهيدي5،6 . الاستراتيجية الثالثة هي قبل سقف النصوص الأولية باستخدام guanylyl transferase، ومن ثم يتم تحديد موقف ثلاثي الفوسفات 5 'تيرميني عن طريق التمديدالتمهيدي جنبا إلى جنب مع ribonuclease أو S1 تحليل حماية nuclease 7،8 ،9. تختلف عن تلك التي تعتمد على وجود / عدم وجود 5 'ثلاثي الفوسفات، والاستراتيجية الرابعة يجمع في النسخ في المختبر، وmutagenesis الموجهة حسب الموقع، وتحليل التمديد التمهيدي لتوصيف المروجين المفترضة وتحديد النسخ بدءمواقع 8،10،11. باستخدام هذه الاستراتيجيات، تم تحديد العديد من النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا النباتية.
ومع ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن 5 'ثلاثي الفوسفات من النصوص الأوليةكانت غير مستقرة، وأنها تحولت بسهولة إلى أحادي الفوسفات لسبب غير معروف 2،4،12،13. وتعوق هذه المشكلة التمييز الواضح بين هذين النوعين من النصوص باستخدام تقنيات تبعاً لوجود/عدم وجود 5'ثلاثي الفوسفات، والجهود السابقة للتمييز المنهجي بين النصوص الأولية والمجهزة في المصنع فشل الميتوكوندريا2،12.
في هذا البروتوكول، ونحن الجمع بين cRT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، RT-qPCR، ووصمة عار الشمالية للتمييز بشكل منهجي النصوص الأولية والمصنعة المتراكمة بشكل ملحوظ في الذرة(Zea mays)mitochondrion (الشكل 1). cRT-PCR يسمح رسم الخرائط في وقت واحد من 5 'و 3' الأطراف من جزيء RNA، وعادة ما يتم تكييفها لخريطة termini نسخة في النباتات2،12،14،15. يمكن أن يزيل الحمض النووي الريبي 5 'polyphosphatase اثنين من الفوسفات من تيرميني ثلاثي الفوسفات 5 '، مما يجعل النصوص الأولية المتاحة للربط الذاتي من قبل الحمض النووي الريبي ligase. وأظهرت الدراسات السابقة أن ناضجة 26S rRNA في الذرة قد عالجت 5 '، وكان غير حساس لRNA 5 'polyphosphatase1،16. لتقليل تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر في الترسيني الأولي 5'، يتم تطبيع 5 'متعدد الفوسفاتات المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل rRNA 26S ناضجة، ثم يتم تمييز النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة cRT-PCR المنتجات التي تم الحصول عليها من عينات RNA اثنين. ويتم التحقق من نتائج رسم الخرائط والتمييز بين اللجنة من خلال اللطخة الشمالية وRT-qPCR، على التوالي. وأخيرا، يتم استخدام التمهيديات البديلة لتضخيم تلك النصوص التي تم الكشف عنها في وصمة عار الشمالية ولكن ليس عن طريق cRT-PCR. باستخدام هذه الاستراتيجية المستندة إلى CRT-PCR، تم تمييز معظم النصوص ثابتة الحالة في ميتوشوندريون الذرة ورسم خرائط1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

في الميتوكوندريا النباتية، تحتوي بعض النصوص ذات الحالة الثابتة على 5'ثلاثي الفوسفات مشتق من بدء النسخ (النصوص الأولية)، في حين تحتوي النصوص الأخرى على 5'أحاديالفوسفات ولدت بعد النسخ (النصوص المجهزة). للتمييز بين هذين النوعين من النصوص، تم وضع العديد من الاستراتيجيات، ويعتمد معظمها على وجود/غياب ثلاثي الفوسفات 5.... ومع ذلك، فإن ثلاثي الفوسفات في المرحلة الابتدائية 5 'تيرميني غير مستقر، وأنه يعوق تمييز واضح من هذين النوعين من النصوص. للتمييز بشكل منهجي وخريطة النصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوشوندريون الذرة، قمنا بتطوير استراتيجية دائرية RT-PCR (cRT-PCR) القائمة على الجمع بين cRT-PCR، الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد البوخباتازي، الكمية RT-PCR (RT-qPCR)، ووصمة عار الشمالية. كتحسين، وتشمل هذه الاستراتيجية خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي للحد من تأثير غير مستقر 5 'ثلاثي الفوسفات.
في هذا البروتوكول، يتم معالجة الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب مسبقا من قبل RNA 5 'polyphosphatase، الذي يحول 5 'triphsophate إلى أحادي الفوسفات. بعد التعميم والنسخ العكسي، يتم تطبيع اثنين من cDNAs المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل الذرة 26S rRNA ناضجة، والتي لديها نهاية معالجة 5 'وغير حساسة ل5'polyphosphatase. وبعد التطبيع، يتم التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من التقييمات RNAs المعالجة وغير المعالجة. يتم تحديد termini النص عن طريق الاستنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ومن ثم التحقق من قبل وصمة عار الشمالية.
باستخدام هذه الاستراتيجية، تم تحديد معظم النصوص ثابتة الدولة في ميتوشوندريون الذرة. بسبب نمط النسخ المعقد لبعض الجينات الميتوكوندريا، لم يتم تمييز بعض النصوص الثابتة و/أو تعيينها، على الرغم من أنها تم اكتشافها في لطخة شمالية. نحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة للتمييز وخريطة النصوص ثابتة الحالة في الميتوكوندريا النباتية الأخرى أو في plastids.

تقدير كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا
في دراسة سابقة، تم استخدام كل من RNAs الكلي والميتوكوندريا لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في أرابيدوبسي (أرابيدوبيس ثاليانا)،وقدم نوعين من RNAs نتائج رسم الخرائ...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

ويستخدم هذا البروتوكول لرسم الخرائط والتمييز في النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا الذرة. وتشمل هذه التقنية خطوة التطبيع RNA وأنها تقلل من تأثير غير مستقر خمسة ثلاثي الفوسفات رئيس الذي يعوق تمييزا واضحا بين النصوص الأولية والمجهزة. وإلى جانب الميتوكوندريا الذرة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على البلاستيدات والميتوكوندريا النباتية الأخرى.ابدأ بجمع 20 غرامًا من الحبوب النامية في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد. نقل حبات إلى مدفع هاون قبل تبريد وإضافة 10 إلى 20 ملليلتر من الجليد الباردة استخراج العازلة. طحن حبات تماما، إضافة المزيد من استخراج العازلة وتصفية الأنسجة الأرضية من خلال طبقتين من القماش تصفية.الطرد المركزي الترشيح في 8، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. ثم نقل فائقة إلى أنبوب جديد والتخلص من الترشيح. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 20،000 مرة G لمدة 10 دقيقة.صب قبالة مفحم وإعادة تعليق بيليه في ستة ملليلتر من العازلة الغسيل. Aliquot التعليق في خمسة 1.5 ملليلتر أنابيب RNase خالية والطرد المركزي لهم في 14،000 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى وتجميد بيليه الميتوكوندريا في النيتروجين السائل.استخراج الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا باستخدام الكواشف التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واقامة RNA خمسة علاج البولي فوسفاتاتاز رئيس. ثم، استرداد الجيش الملكي النيبالي مع عدة تنقية الحمض النووي الريبي. الكاشف المستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي هو خطر.دائماً العمل معها في غطاء الدخان وارتداء دائما معطف المختبر والقفازات. إعداد اثنين من ردود الفعل التعميم باستخدام نفس الكميات من خمسة رئيس polyphosphatase المعالجة وغير المعالجة الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا. احتضان كل من ردود الفعل في 16 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة ومن ثم استعادة الحمض النووي الريبي الذاتي مع مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المستخدمة سابقا.ابدأ بإعداد خليط التمهيدي بنسبة مساوية لـ 26 SCRT وما يصل إلى سبعة التمهيدية أخرى للنسخ العكسي. تجميع نظامين رد فعل النسخ العكسي وفقا لاتجاهات المخطوطة واحتضانها عند 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. لتطبيع الحمض النووي، إعداد رد فعل PCR اثنين مع نفس حجم cDNA من خمسة رئيسي polyphosphatase المعالجة أو غير المعالجة RNA وتشغيل رد الفعل تحت ظروف الدراجات الحرارية الموصوفة في المخطوطة.التطبيع من قبل 26S RRNA ناضجة هي خطوة رئيسية للتمييز بين النصوص الأولية والمجهزة. قارن وفرة من اثنين من المنتجات PCR وإذا لزم الأمر، وتحسين التطبيع عن طريق ضبط كميات من قالب cDNA. إعداد أزواج من ردود الفعل PCR مع وحدات التخزين المناسبة من cDNA تطبيع وزوج من التمهيديات المتباينة كما هو الحال في رئيس الوزراء خمسة إلى ثلاثة تقاطع رئيس من النصوص المستهدفة وأداء PCR وفقا لتوجيهات المخطوطة.ثم، استخدم مجموعة استرجاع الحمض النووي هلام لعزل الشرائط البارزة التي يتم تضخيمها بواسطة PCR متداخلة. استنساخ هلام تنقية منتجات PCR في ناقل باستخدام التقنيات القياسية وتنفيذ PCR مستعمرة لتحديد استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج الهدف. تسلسل منتجات PCR ومواءمة البيانات تسلسل مع الجينوم الميتوكوندريا الذرة باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية أو انفجار.اختيار الذرة الكائن الحي والبحث في جمع نووكليوتيد قاعدة البيانات. العثور على رئيس الوزراء خمسة إلى ثلاثة تقاطع رئيس الوزراء من النص المعمم وتحديد مواقف خمسة رئيس الوزراء وثلاثة نص رئيس تيرميني. تضخيم جزء الحمض النووي المستخدمة لإعداد مسبار الحمض النووي الريبي واستنساخه إلى المتجه المستخدم سابقًا والذي يحتوي على مروج T7 ، 17 زوجًا أساسيًا في المنبع لموقع الإدراج.تسمية تحقيقات الجيش الملكي النيبالي مع حفر-11-UTP وتنفيذ التهجين RNA باستخدام مجموعات تجارية. تمييز في الغايات الأولية الخمسة الرئيسية المعالجة من خلال مقارنة منتجات RT-PCR الدائرية التي تم الحصول عليها من خمسة من البوليفوسفاتاتيز الرئيسي المعالج وغير المعالج للرنا. ثم تصميم التعديلات الكمية RT-PCR استناداً إلى نتائج رسم الخرائط والتحقق من نتائج التمييز مع RT-PCR.وقد استُخدِم جين COX-2 كمثال لإثبات رسم خرائط وتفرقة سجلات الميتوكوندريا من الذرة من خلال الاستراتيجية الدائرية القائمة على RT-PCR. واستخدمت cDNA تطبيع كنماذج ل PCR، مما أدى إلى اثنين من العصابات البارزة تضخيم من عينة المعالجة الخمسة الرئيسي polyphosphatase. وسمي النطاقين كوكس-2 واحد واثنين تم استردادهما من الجل واستنساخهما في ناقلات.وأظهرت نتائج PCR مستعمرة أن استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج مع حجم متغير مما يعني أن الارميني لديها خمسة رئيس الوزراء أو ثلاثة رئيس تيرميني غير متجانسة. وأظهرت نتائج التسلسل أن COX-2 واحد واثنين لديهم نفس الغايات الرئيسية الثلاثة في 39 نوكليوتيدات المصب من كودون وقف في حين تقع التسميني الرئيسي الخمسة في 992 إلى 1، 030 و 1، 276 إلى 1، 283 النيوكليوتيدات المنبع من كودون البداية، على التوالي. تم إجراء تهجين RNA جل لطخة للتحقق من نتائج الخرائط RT-PCR التعميم واثنين من النطاقات الرئيسية مع أحجام مماثلة ل COX-2 واحد واثنين تم الكشف عن.تم تصميم زوج آخر من ال التمهيديات المتباينة لتضخيم النطاقات الثلاث والأربعة COX-2 التي تم اكتشافها مع لطخة هلام RNA ولكن ليس مع المرة الأولى الدائري RT-PCR. أكدت النتائج الكمية RT-PCR أن COX-2 واحد واثنين وثلاثة وأربعة كانت حساسة لخمسة من البوليفوسفاتاز الرئيسي وأنهم لديهم خمسة الابتدائي الترميني الرئيسي. يمكن إجراء تحليل ملحق التمهيدي للتحقق من نتائج تعيين خمسة رئيسية على الرغم من أنه غير مضمن في هذا البروتوكول.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في<em&gt; التوكسوبلازما غونديي</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...