Name: rapid isolation of dorsal root ganglion macrophages
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages at JoVE.com

Çalışma şu şekilde desteklenmiştir: Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı (XY); UCSF Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü (XY); ve 1R01NS100801-01(GZ). Bu çalışma kısmen HDFCCC Laboratuvar Hücre Analizi Paylaşılan Kaynaklar Tesisi tarafından NIH (P30CA082103) hibe si ile desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Deneysel farelerden lomber DRG toplamak
<ol><li>Deneye başlamadan önce, 9 ciltlik ortayı 1 birim Ca++ /Mg++-free 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin, Percoll) çalışma çözümünün hazırlanın. Buz...

<ol>
	<li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation.">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li><li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuropathic+pain:+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat.">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li><li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma.">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).</li><li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling.">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li><li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy.">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li><li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury.">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li><li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury.">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029 (2016).</li><li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia.">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li><li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IKK/NF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury.">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li><li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia.">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li><li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury.">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li><li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury.">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li><li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11b+Ly6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity.">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release.">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li><li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene.">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li><li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury.">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).</li><li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain.">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase.">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li></ol>

Burada etkili fare DRG izole makrofajlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanıtmak. DRG bağışıklık hücrelerini izole etmek için geleneksel yaklaşım enzimatik sindirim gerektirir15,18, şimdi istenmeyen hücre hasarı sınırlamak ve verimi artırmak için protokolümüzde mekanik homojenizasyon ile değiştirilir. Bu nedenle, yeni protokol çok daha az zaman alıcıdır. Daha da önemlisi, enzim sindirim makrofajlar uyarabilir ve moleküler imzay...

Bağışıklık hücrelerinin periferik sinir hasarı sonrası nöropatik ağrıkatkıda önemli kanıtlar var1,2. Olgun makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına ve sistemik enfeksiyona yanıt verebildiği bilinmektedir. Spinal dorsal boynuz sinir yaralanması kaynaklı mikroglia aktivasyonu paralel, dorsal kök gangliyonu makrofajlar (DRG) ayrıca sinir yaralanması sonra önemli ölçüde genişletmek3,4. Özellikle, makrofajlar DRG duyusal nöronlar ile etkileşime girerek periferik sinir yaralanması sonrası nöropatik ağrı gelişimine katkıda olup olmadığını belirlemek için büyüyen ilgi vardır5,6,7, 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11. Ayrıca, son çalışmalar da sinir yaralanması12sonra aksonal onarım DRG makrofajların katkısı ima12 ,13. Başka bir çalışmada ayrıca makrofaj alt popülasyonlarının (cd11b+Ly6Chi ve CD11b+Ly6Cdüşük/- hücreler) mekanik aşırı duyarlılıkta farklı bir rol oynayabileceğini öne sürer14. Bu nedenle, sinir hasarı bağlamında DRG makrofajların yanıtını hızla fenotipleme bize nöropatik ağrıya katkıda nöroimmün faktörleri belirlemenize yardımcı olabilir.
Geleneksel olarak, DRG makrofajlar izole etmek için protokol enzimatik sindirim 15 ,16dahil olmak üzere birden fazla adım içerir. Teknik genellikle zaman alıcıdır ve büyük ölçekli deneyler için maliyetli olabilir. Kollajenaz tip II (4 mg/mL) ve dispase tip II (4.7 mg/mL) ile hafif sindirim daha önce tavsiye edilse de15dakika , bu enzime maruz kaldıktan sonra hücrelerin hücre hasarına veya hücre ölümüne yatkın olması akla yatkındır, bu da düşük hücre hasarına veya hücre ölümüne yol açabilir Verim. Buna ek olarak, seriden toplu ait enzimlerin kalitesindeki fark bu sürecin verimliliğini daha da etkileyebilir. Daha da önemlisi, enzim sindirimine maruz kalan makrofajlar istenmeyen bir şekilde uyarılabilir ve böylece in-vivo durumundan çok farklı olabilir. Değişiklikler, fonksiyonel çalışmanın sonucunu karmaşık hale getirebilir.
Burada 4 °C'de DRG makrofajlarını mekanik ayrışma kullanarak hızla izole etmek için enzimsiz bir protokol uyguluyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için buzüzerinde tutulur. Sonuç olarak, bizim yaklaşım izolasyon tutarlılığını korumak için bir avantaj sağlar, ve izole hücreler muhtemelen sağlıklı ve daha az uyarılmış. Ayrıca Floresan aktive Hücre Sıralama (FACS) analizi ile izole hücrelerin kalitesini doğrulamak için kanıt salıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AP20187</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-mouse CX3CR1-APC antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 mm nylon)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue homogenizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538 (1ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (5ml)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x, Ca++/Mg++-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>15012-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4937-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation of dorsal root ganglion macrophages

Periferik sinir hasarı sonrası dorsal kök gangliyonunda bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri incelemek için artan ilgi alanları vardır. Makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına yanıt verebildiği bilinmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar sinir hasarı bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök gangliyon makrofajlar katkısı ima etmiştir. Hızla fenotipleme (veya "hızlı izolasyon") sinir yaralanması bağlamında dorsal kök ganglia makrofajlarının yanıtı bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için boyunca buz üzerinde tutulur. Bu protokol standart enzimatik protokole göre çok daha az zaman alır ve floresan tarafından aktive edilen Hücre Sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullanılmaktadır.

İzole hücreleri doğrulamak için, ilk Macrofaj Fas kaynaklı Apoptosis seçti (MAFIA) transgenik fareler17. Bu çizgi, özellikle makrofajlar ve mikroglia ile ifade edilen BOS1 reseptörünün (BOS1R) promotörü kontrolü altında ilaç lainebilir fk506 bağlayıcı protein (FKBP)-Fas intihar füzyon geni ve yeşil floresan proteini (eGFP) ifade eder. FK bağlayıcı protein dimerizer sistemik enjeksiyon, AP20187 (AP), transgeni ifade eden hücrelerin apoptosis indükler. EGFP ifadesi de bize ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages at JoVE.com

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Burada, fenotitipleme ve fonksiyonel analiz için dorsal kök ganglion'undaki makrofajları hızla izole etmek için mekanik bir ayrışma protokolü salıyoruz.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Ortaya çıkan kanıtlar sinir yaralanması bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök ganglion makrofajlar katkısı ima etmiştir. Dorsal kök ganglion makrofajlarının yanıtı hızla fenotipleme bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz.Bu protokol standart enzimatik protokollere kıyasla çok daha az zaman alır ve biz bunu floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullandık. Deneye başlamadan önce, dokuz ciltlik orta yı kalsiyum ve magnezyumsuz 10X HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının çalışma çözümlerini hazırlayın ve buzda tutun. Farenin arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın.Bant ile sabitlenmiş dört pençeleri ile supine pozisyonda bir kimyasal duman kaput içinde bir anestezili fare yerleştirerek başlayın. Göğüs kafesinin altındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Ve sonra cerrahi makas ile, karaciğer ve diyafram ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapmak.Aynı makas kullanarak, diyafram ve göğüs kafesi kesti. Ve sonra atan kalbi ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın. Iris makas ile sonraki, hızlı bir şekilde sağ atriyal eki kesti.Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve hayvana nüfuz etmek için yavaş yavaş 10 mililitre önceden soğutulmuş 1X PBS enjekte edin. Dorsal laminektomi yapmak için fareyi yatkın konuma getirin. Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar iki boylamsal lateral derin kesi yapmak için bir boyut 11 neşter kullanın.Sonra dorsal kas tabakası açığa deri kaldırın. Daha sonra Friedman-Pearson rongeur ile, lumbosacral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler maruz kalana kadar bağ dokuları ve kasları soyma. İlk olarak, dikkatle dorsal spinal kolonu açmak için bir Friedman-Pearson rongeur kullanın, sonra vertebra kemikleri kaldırmak için bir Friedman-Pearson rongeur ve Noyes bahar makası arasında geçiş, sağlam spinal sinirler bağlı omurilik açığa.Dikkatle ipsilateral ve kontrlateral lomber DRG diseksiyon. Bir milimetrelik buz gibi kalsiyum ve magnezyumsuz 1X HBSS'ye yerleştirin. 20 ila 25 kez gevşek bir pestle ile Dounce homogenizer DRG doku homojenize.Steril bir steril 70 mikrometre naylon hücreli süzgeç steril bir 50 mililitrekonik tüp yerleştirin. Hücre süzgecini ıslamak için 800 mikrolitre buz kodu 1X HBSS kullanın. Homojenize doku süspansiyonu ile Homojenleştiriciden ıslak hücresüze almak ve 50 mililitrelik konik tüpe toplamak için bir pipet kullanın.Homogenizer'i 800 mikrolitre buz soğuğu 1X HBSS ile iki kez durulayın ve sıvıyı aynı 50 mililitrelik konik tüpe toplayarak verimi artırın. Steril beş mililitre polistiren şişe tüpü içine dengelenmiş buz soğuk izotonik yoğunluk gradyan orta 1,5 mililitre ekleyin. Hücrehomojen50 mililitrelik konik tüpten bu şişe tüpüne aktarın.Ve pipet yukarı ve aşağı iyi karıştırmak için. Üst mühür için 1X HBSS ek 500 mikrolitre ekleyin. Hücreleri 800 kez G'de 20 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Tüpün altındaki hücre peletini rahatsız etmeden orta ortamda miyelin içeren süpernatantı dikkatlice aspire edin. Pelete %5 fetal sığır serumu içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin ve DRG hücrelerini yeniden askıya alın. Sonra hücrelere alfa fare CX3CR1 APC antikor ekleyin ve bir saat boyunca dört derece santigrat karanlıkta kuluçka.Hücreleri bir kez beş mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri 360 kez G'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüj edin. Supernatant aspirate ve sonra tekrar hücre pelet askıya 300 mikrolitre PBS gerçekler analizi için.Makrofajları tüketmek için MaFIA farelere FK-bağlayıcı protein dimerizer AP intraperitoneal enjeksiyonları sonra, kontrollü araç tedavi fareler ile karşılaştırıldığında AP tedavi farelerin DRGs GFP pozitif hücrelerin önemli bir kaybı vardı. Gerçekler analizi AP tedavi farelerde GFP yüksek nüfus başarılı bir tükenmesi ortaya ve izole hücrelerin yüksek kalitesini gösterdi. Araç tedavi edilen hayvanların DRG'sinden toplam izole hücrelerin %4'ü GFP yüksek makrofajlardı.Buna karşılık toplam DRG hücrelerinin sadece %0.4'ü AP-treated farede GFP yüksek makrofajlardı. Yabani farelerden mekanik olarak izole edilmiş DRG hücreleri alfa fare CX3CR1-APC antikorile boyandı. DRG hücrelerinin %6'sı CX3CR1 pozitif makrofajlardı.Hücre canlılığı propidium iyodür ile değerlendirildiğinde, taze izole DRG hücrelerinin %80'inden fazlasının canlı olduğunu ortaya koymuştur. Yetersiz hücre verimi belirtilmişse, DRG dokusunun yetersiz veya aşırı homojenizasyonundan şüphelenilebilir. Buna ek olarak, DRG diseksiyon yeni başlayanlar için tekrarlanan uygulama gerektirebilir.Muhtemelen protokolümüzün uygulaması uydu hücreleri ve T hücreleri gibi diğer nöronal olmayan hücreleri incelemek için genişletilebilir. Hücre izolasyonunun etkinliğini doğrulamak için daha ileri çalışmalar gerekebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Nörobilim

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Lomber Dorsal kök gangliyon erişim ve domuz yerleştirmeye laminotomy

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...