Den selektive intra-bronkial metode er signifikant, fordi det giver efterforskerne en reproducerbar og nonlethal model for at studere akut lungeskade, en væsentlig årsag til akut respiratorisk distress syndrom hos mennesker. Fordelen ved den selektive intra-bronkial teknik er lokalisering af den inflammatoriske reaktion på venstre lunge tilbyder den rigtige lunge som en uskadt kontrol og minimere dyrs nød. Demonstrere denne procedure vil være Alexander Tavares, en tekniker og prægraduate studerende i vores laboratorium.
For at forberede 0,1 normal saltsyre tilsættes 11 milliliter dobbeltdestilleret vand til en ravglasflaske efterfulgt af en langsom tilsætning af en milliliter 37%12 normal syre. Dernæst langsomt tilføjes fire milliliter af en normal syre arbejder lager i 35 milliliter dobbelt destilleret vand i en 50-milliliter konisk rør. Brug derefter en elektronisk pH-sonde til at måle pH-signaturen for den normale lageropløsning på 0,1, der titrerer til en pH-værdi på 1,1 ved hjælp af natriumhydroxid eller syrelageropløsning efter behov til et endeligt volumen på 40 milliliter.
Før proceduren påbegyndes, filtreres en til to milliliter af syreopløsningen gennem et sterilt 0,22 mikroliterfilter i et sterilt mikrocentrifugerør, og der bekræftes manglende reaktion på smerterefleks i en bedøvet mus. Brug af elektriske klippere i langsomme nedadgående strøg barberer forsigtigt det kirurgiske område på musens ventrale overflade under hagen i halsregionen. Fjern eventuelt løst hår, og podning den eksponerede hud med tre på hinanden følgende 10% povidone-jod opløsning og 70% isopropyl alkohol svaberprøver.
Når huden er blevet prepped, placere musen i liggende position på en ren kirurgisk bord, og dække dyret med en steril kirurgisk drapere. Lav en langsgående 0,5 centimeter åbning i huden over luftrøret og spytkirtlerne, og brug let buede savtakkede kraftvipper til omhyggeligt at trække huden tilbage. Adskære forsigtigt spytkirtlerne for at eksponere trakealmusklerne og brug let buede savtakkede kraftvipper til forsigtigt at skubbe paratrachealmuskulmusklerne ad.
Drille væk fascia omkring luftrøret, indtil bruskiske ringe af luftrøret er helt eksponeret, og bruge fuldt buede savtakkede kraftvipper til at arbejde væk bindevæv mellem retrotrachea og retrofascia. Skub fuldt buede savtakkede snævner bag luftrøret og løft luftrøret. Når spidsen af snæveren er bag luftrøret, forstå en 10 til 15 centimeter stykke 4-0 flettet silke sutur med spidsen af stænt og trække suturen bag luftrøret, så der er en jævn længde på hver side.
Det kirurgiske board kan drejes for at bringe det kirurgiske område tættere på den dominerende hånd for de næste skridt. Træk derefter forsigtigt enderne af suturen mod musens forreste, og hold enderne på plads. For cannulation af venstre mainstem bronkus, udsætte nålen af en 24-gauge ved 3/4-tommer angiocatheter og indsætte nålen facet side op i det indre område af luftrøret mellem den første og anden luftrør ringe.
Når nålespidsen kan visualiseres i luftrøret lumen, slip suturen og før kanylen over nålen ind i luftrøret, der lystfiskerier mod venstre bageste side af musen. Når der opstår modstand, trækkes nålen tilbage. Når kanylen er på plads, skal du tage godt fat i injektionsporten for at forhindre kateteret i at flytte og sikre en P-200 mikropipettespids i porten.
Derefter indgydes 50 mikroliter af den filtrerede 0,1 normal syreopløsning i kateteret, efterfulgt af et tilsvarende luftvolumen. Dette trin kræver præcis manipulation af kanylen, mens luftvejene er blokeret, og bør udfyldes hurtigt og gnidningsløst for at genoprette korrekt luftstrøm og for at minimere luftvejsskader. Træk hurtigt kateteret tilbage og vip det kirurgiske board i en vinkel på 60 grader.
Efter 30 sekunder, lægge kirurgisk bord flad, og fjerne suturen bag luftrøret. Brug derefter en 4-0 voksbelagt flettet silkesutur for at lukke hudsnitt med to til tre sting. Den akutte lungeskade som følge af intra-bronkiale syre instillation indebærer hele venstre lunge.
Faktisk, efter intravenøs administration af Evans blå farvestof og lungeperfusion, farvestoffet påvises kun inden for venstre lunge. Kvantificering af farvestoffet ekstravasation i venstre lunge er væsentligt øget i forhold til fingeret selektiv instillation. Interstitielle neutrofiler ophobes i venstre lunge 24 timer efter syre instillation i modsætning til højre lunge, hvor kun få interstitielle neutrofiler er observeret.
Lungehistologi afslører vævsskade og betændelse på organ- og celleniveau med ekssudativ inflammation 24 timer efter skaden som karakteriseret ved markant alveolær ødem og neutrofil infiltration i venstre lunge. Bemærk, at manglen på betydelig skade eller leukocyte tilstrømning i den uskadte kontrol højre lunge. 72 timer efter skade ødem og cellulære infiltrater er væsentligt nedsat repræsenterer en løsning exudative fase.
Som vurderet af flow cytometri, alveolær neutrofiler stigning i venstre lunge 24 timer efter den første skade, og falde betydeligt på 48 og 72 timer. Det er vigtigt at visualisere kateteret i luftrøret, før det går videre. Vinkl kanylen mod venstre hovedstme bronkier under indsættelse og følg syre instillation med 50 mikroliter af luft.
Bronchoalveolar lavage væske analyse, lunge histologi, immuncelle fænotypebestemmelse ved flow cytometri, levende mus billeddannelse, og lungefunktion test kan alle udføres for at vurdere inflammation og opløsning. Udviklingen af denne selverknede model for akut lungeskade har gjort det muligt for forskere at yde betydelige bidrag til området for løsning biologi. Husk, at koncentreret saltsyre er farlig, og at den skal håndteres i en kemisk hætte iført det relevante personlige værnemidler.
