La méthode intra-bronchique sélective est significative parce qu’elle offre aux chercheurs un modèle reproductible et non létal pour étudier les lésions pulmonaires aiguës, une cause majeure du syndrome de détresse respiratoire aiguë chez l’homme. L’avantage de la technique intra-bronchique sélective est la localisation de la réponse inflammatoire au poumon gauche offrant le poumon droit comme un contrôle non blessé et minimisant la détresse animale. Alexander Tavares, technicien et étudiant en prégraduate dans notre laboratoire, démontrera cette procédure.
Pour préparer 0,1 acide chlorhydrique normal, ajouter 11 millilitres d’eau distillée double à une bouteille en verre ambré, suivi de l’ajout lent d’un millilitre d’acide normal de 37%12. Ensuite, ajoutez lentement quatre millilitres d’un bouillon de travail acide normal en eau distillée double de 35 millilitres dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez une sonde de pH électronique pour mesurer le pH de la solution de stock normal de 0,1, titrant à un pH de 1,1 en utilisant l’hydroxyde de sodium ou la solution de stock acide au besoin à un volume final de 40 millilitres.
Avant de commencer la procédure, filtrer un à deux millilitres de la solution acide à travers un filtre stérile de 0,22 microlitre dans un tube de microcentrifugeuse stérile et confirmer un manque de réponse au réflexe de douleur chez une souris anesthésiée. À l’aide de tondeuses électriques dans les coups lents vers le bas, raser doucement la zone chirurgicale sur la surface ventrale de la souris sous le menton dans la région cervicale de la gorge. Enlevez tous les cheveux lâches, et écouvillonnez la peau exposée avec trois solution consécutive de 10% povidone-iode et 70% d’écouvillons d’alcool d’isopropyl.
Lorsque la peau a été préppée, placez la souris en position supinée sur une planche chirurgicale propre et recouvrez l’animal d’un drapé chirurgical stérile. Faire une ouverture longitudinale de 0,5 centimètre dans la peau au-dessus de la trachée et les glandes salivaires, et utiliser des forceps dentelés légèrement incurvés pour rétracter soigneusement la peau. Séparez doucement les glandes salivaires pour exposer les muscles trachéaux et utilisez des forceps dentelés légèrement incurvés pour repousser doucement les muscles paratrachés.
Taquinez le fascia entourant la trachée jusqu’à ce que les anneaux cartilagineux de la trachée soient complètement exposés, et utilisez des forceps dentelés entièrement incurvés pour éloigner le tissu conjonctif entre la rétrotrachea et la retrofascia. Glissez des forceps dentelés entièrement incurvés derrière la trachée et soulevez la trachée. Une fois que la pointe des forceps est derrière la trachée, saisir un morceau de 10 à 15 centimètres de suture de soie tressée 4-0 avec les extrémités des forceps et tirer la suture derrière la trachée de sorte qu’il ya une longueur même de chaque côté.
Le conseil chirurgical peut être tourné pour rapprocher la zone chirurgicale de la main dominante pour les prochaines étapes. Puis tirez doucement les extrémités de la suture vers l’antérieur de la souris, et maintenez les extrémités en place. Pour la cannulation de la bronche du tronc principal gauche, exposer l’aiguille d’un angiocathéter de 3/4 de pouce de jauge par 3/4 de pouce et insérer le côté biseauté de l’aiguille vers le haut dans la région intérieure de la trachée entre le premier et le deuxième anneaux trachéaux.
Lorsque la pointe de l’aiguille peut être visualisée dans le lumen trachéal, relâchez la suture et avancez la canule au-dessus de l’aiguille dans la trachée qui pend vers le côté postérieur gauche de la souris. Lorsque des résistances se sont rencontrées, retirez l’aiguille. Une fois la canule en place, saisissez fermement le port d’injection pour empêcher le cathéter de se déplacer et fixez une pointe de micropipette P-200 à l’intérieur du port.
Puis inculquer 50 microlitres de la solution acide normale filtrée 0,1 dans le cathéter, suivie d’un volume égal d’air. Cette étape nécessite une manipulation précise de la canule, tandis que les voies respiratoires sont obstruées, et doit être complétée rapidement et en douceur pour rétablir le flux d’air approprié et minimiser les dommages aux voies respiratoires. Retirez rapidement le cathéter et inclinez le conseil chirurgical à un angle de 60 degrés.
Après 30 secondes, poser la planche chirurgicale à plat, et enlever la suture derrière la trachée. Ensuite, utilisez une suture en soie tressée enrobée de cire 4-0 pour fermer l’incision cutanée avec deux à trois points de suture. Les lésions pulmonaires aiguës résultant de l’instillation d’acide intra-bronchique impliquent l’ensemble du poumon gauche.
En effet, suite à l’administration intraveineuse de colorant bleu Evans et de perfusion pulmonaire, le colorant n’est détecté que dans le poumon gauche. La quantification de l’extravasation de colorant dans le poumon gauche est sensiblement augmentée par rapport à l’instillation sélective simulée. Les neutrophiles interstitiels s’accumulent dans le poumon gauche 24 heures après instillation acide contrairement au poumon droit dans lequel peu de neutrophiles interstitiels sont observés.
L’histologie de poumon indique des dommages de tissu et l’inflammation aux niveaux d’organe et cellulaires avec l’inflammation exsudative 24 heures après dommages comme caractérisé par l’oedème alvéolaire marqué et l’infiltration de neutrophile dans le poumon gauche. Notez que l’absence de blessures significatives ou l’afflux de leucocytes dans le poumon droit de contrôle non blessé. 72 heures après des dommages l’oedème et les infiltrations cellulaires sont sensiblement diminués représentant une phase exsudative de résolution.
Comme évalué par cytométrie de flux, les neutrophiles alvéolaires augmentent dans le poumon gauche 24 heures après la blessure initiale, et diminuent sensiblement à 48 et 72 heures. Il est important de visualiser le cathéter dans la trachée avant d’avancer. Inclinez la canule vers la bronche du tronc principal gauche pendant l’insertion et suivez l’instillation acide avec 50 microlitres d’air.
L’analyse bronchoalveolar de fluide de lavage, l’histologie de poumon, le phénotypage de cellules immunisées par cytométrie d’écoulement, l’imagerie vivante de souris, et l’essai pulmonaire de fonction peuvent tous être exécutés pour évaluer l’inflammation et la résolution. Le développement de ce modèle auto-limité de lésions pulmonaires aiguës a permis aux chercheurs d’apporter des contributions significatives dans le domaine de la biologie de la résolution. N’oubliez pas que l’acide chlorhydrique concentré est dangereux et qu’il doit être manipulé dans une hotte chimique portant l’équipement de protection individuelle approprié.
