選択的気管支内法は、ヒトにおける急性呼吸窮迫症候群の主な原因である急性肺損傷を研究するための再現性および非致死性モデルを研究者に提供するため、有意である。選択的気管支内技術の利点は、左肺に対する炎症反応の局在化が、傷つかずのコントロールとして右肺を提供し、動物の苦痛を最小限に抑えることである。この手順をデモンストレーションするアレクサンダー・タバレス, 私たちの研究室の技術者と大学院生.
0.1通常の塩酸を調製するには、アンバーガラス瓶に11ミリリットルの二重蒸留水を加え、続いて37%12の正常な酸の1ミリリットルのゆっくりとした添加を加えます。次に、1つの正常な酸作業ストックの4ミリリットルを50ミリリットルの円錐管に35ミリリットルの二重蒸留水にゆっくりと加える。次に、電子pHプローブを使用して、0.1の通常のストック溶液のpHを測定し、必要に応じて水酸化ナトリウムまたは酸ストック溶液を使用して1.1のpHまで測定し、40ミリリットルの最終体積にします。
手順を開始する前に、無菌0.22マイクロリットルフィルターを通して酸溶液の1〜2ミリリットルを無菌マイクロ遠心分離チューブにフィルターし、麻酔薬での疼痛反射に対する応答性の欠如を確認します。ゆっくりと下向きのストロークで電気バリカンを使用すると、喉の頸部領域の顎の下のマウスの腹側表面の外科的領域を穏やかに剃る。任意の緩い髪を除去し、3つの連続した10%ポビドネヨウ素溶液と70%イソプロピルアルコール綿棒で露出した皮膚を綿棒。
皮膚が準備されたら、きれいな外科用ボードの上の位置にマウスを置き、無菌の外科用ドレープで動物を覆う。気管と唾液腺の上の皮膚に縦方向の0.5センチメートルの開口部を作り、慎重に皮膚を引っ込めるためにわずかに曲がった鋸歯状鉗子を使用する。唾液腺を穏やかに分離して気管の筋肉を露出させ、わずかに曲げられた鋸歯状の鉗子を使用してパラトラクサー筋肉を静かに押し出す。
気管の軟骨環が完全に露出するまで気管を囲む鼻隠しをいじめ、完全に湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して、レトロ気管とレトロファスキアの間の結合組織を取り除きます。気管の後ろに完全に湾曲した鋸歯状の鉗子をスライドさせ、気管を持ち上げます。鉗子の先端が気管の後ろにあるら、鉗子の先端を持つ4-0編み糸縫合糸の10〜15センチメートルの部分をつかみ、気管の後ろに縫合糸を引っ張り、両側に均一な長さがある。
外科の板は次のステップのために支配的な手に近い外科区域を持って来ることができる。次に、縫合糸の端をマウスの前部にそっと引っ張り、端を所定の位置に保持します。左メインステム気管支のカヌレーションの場合は、3/4インチの血管カテーテルで24ゲージの針を露出させ、針ベベル側を第1および第2の気管リングの間の気管の内部領域に挿入する。
針先が気管腔内で可視化できる場合は、縫合糸を解除し、マウスの左後部側に向かって傾いている気管に針の上にカニューレを進めます。抵抗に遭遇した場合は、針を引き出します。カニューレが所定の位置に設置されたら、注入口をしっかりとつかんでカテーテルがずれないようにし、ポート内のP-200マイクロピペットチップを固定します。
次に、濾過された0.1の正常な酸溶液の50マイクロリットルをカテーテルに植え込み、続いて同量の空気を入れる。このステップは、気道が妨害されている間、カニューレの正確な操作を必要とし、適切な気流を復元し、気道の損傷を最小限に抑えるために迅速かつスムーズに完了する必要があります。カテーテルを迅速に引き出し、60度の角度で外科用基板を傾けます。
30秒後、外科用基板を平らにして、気管の後ろから縫合を取り除きます。その後、4〜0ワックスコーティングされた編組シルク縫合糸を使用して、皮膚切開を2〜3針で閉じます。気管支内の酸の点眼に起因する急性肺損傷は、左肺全体を含む。
実際、エバンスブルー染料および肺灌流の静脈内投与後、色素は左肺内でのみ検出される。左肺への色素飛び出しの定量は、恥の選択的な吸入に対して有意に増加する。間質性好中球は、間質性好中球が少ない右肺とは対照的に、酸吸入の24時間後に左肺に蓄積する。
肺組織学は、左肺内の顕著な肺胞浮腫および好中球浸潤によって特徴付けられるように傷害の24時間後に滲出性炎症を伴う器官および細胞レベルにおける組織損傷および炎症を明らかにする。重大な傷害または白血球の流入の欠如は、損傷を受けていないコントロール右肺に注意してください。72時間後に、浮腫および細胞浸潤物が実質的に減少し、治癒滲出期を表す。
フローサイトメトリーにより評価されるように、肺胞好中球は最初の傷害の24時間後に左肺で増加し、48時間および72時間で実質的に減少する。前進する前に気管のカテーテルを視覚化することが重要です。挿入時に左メインステム気管支に向かってカニューレを角度付けし、50マイクロリットルの空気で酸点光に従います。
気管支肺胞洗浄液の分析、肺の構造、フローサイトメトリーによる免疫細胞の定型化、生きたマウスイメージング、および肺機能検査はすべて、炎症と分解能を評価するために行うことができる。急性肺損傷のこの自己限定モデルの開発は、研究者が解決生物学の分野に多大な貢献をすることを可能にしました。濃縮塩酸は危険であり、適切な個人用保護具を着用した化学フードで処理する必要があることを覚えておいてください。
