Den selektive intra-bronkial metoden er betydelig fordi den gir forskerne en reproduserbar og ikke-dødelig modell for å studere akutt lungeskade, en viktig årsak til akutt respiratorisk nødsyndrom hos mennesker. Fordelen med selektiv intra-bronkial teknikk er lokaliseringen av den inflammatoriske responsen på venstre lunge som tilbyr høyre lunge som en uskadet kontroll og minimerer dyreproblemer. Viser denne prosedyren vil være Alexander Tavares, en tekniker og pregraduate student i vår lab.
For å forberede 0,1 normal saltsyre, tilsett 11 milliliter dobbelt destillert vann til en gul glassflaske, etterfulgt av den langsomme tilsetningen av en milliliter på 37% 12 normal syre. Deretter legger du sakte til fire milliliter av en vanlig syre arbeider lager i 35 milliliter dobbelt destillert vann i en 50-milliliter konisk rør. Bruk deretter en elektronisk pH-sonde til å måle pH-en til den 0,1 normale lagerløsningen, og titrerer til en pH på 1,1 ved hjelp av natriumhydroksid- eller syrelagerløsning etter behov til et endelig volum på 40 milliliter.
Før du begynner prosedyren, filtrere en til to milliliter av syreoppløsningen gjennom et sterilt 0,22 mikroliterfilter i et sterilt mikrocentrifugerør og bekreft mangel på respons på smerterefleks i en bedøvet mus. Ved hjelp av elektriske clippers i langsomme nedadgående slag barberer du forsiktig det kirurgiske området på musens ventrale overflate under haken i halshalsområdet. Fjern eventlt løs hår, og vattpinne den eksponerte huden med tre påfølgende 10% povidone-jodoppløsning og 70% isopropylalkoholservietter.
Når huden er klargjort, plasser musen i liggende stilling på et rent kirurgisk bord, og dekk dyret med et sterilt kirurgisk draper. Lag en langsgående 0,5 centimeter åpning i huden over luftrøret og spyttkjertlene, og bruk litt buede taggete tang for å trekke forsiktig tilbake huden. Separer spyttkjertlene forsiktig for å eksponere trakealmuskulaturen og bruke litt buede taggete tang for å forsiktig skyve paratrakealmuskulaturen.
Erte bort fascia rundt luftrøret til de brusk ringene i luftrøret er helt utsatt, og bruk fullt buede taggete tang for å arbeide bort bindevevet mellom retrotrachea og retrofascia. Skyv de fullstendig buede, taggete tangene bak luftrøret og løft luftrøret. Når spissen av tangen er bak luftrøret, ta tak i et 10 til 15 centimeter stykke 4-0 flettet silkesutur med tuppene på tangen og trekk suturen bak luftrøret slik at det er en jevn lengde på hver side.
Kirurgisk bord kan dreies for å bringe det kirurgiske området nærmere den dominerende hånden for de neste trinnene. Trekk deretter forsiktig endene av suturen mot musens fremre, og hold endene på plass. For hermetonering av venstre mainstem bronkier, utsett nålen på en 24-gauge med 3/4-tommers angiocatheter og sett nålen skråsiden opp i det indre området av luftrøret mellom første og andre trakeal ringer.
Når nålespissen kan visualiseres i trakeallummen, slipp suturen og før kanylen over nålen inn i luftrøret som fisker mot venstre bakre side av musen. Når motstand oppstår, trekk nålen tilbake. Når kanylen er på plass, må du ta tak i injeksjonsporten for å hindre at kateteret skifter og fester en P-200 mikropipettespiss i porten.
Deretter innpode 50 mikroliter av den filtrerte 0,1 normal syreoppløsningen i kateteret, etterfulgt av et likt volum luft. Dette trinnet krever presis manipulering av kanylen, mens luftveiene er blokkert, og bør fullføres raskt og jevnt for å gjenopprette riktig luftstrøm og for å minimere luftveisskader. Trekk raskt kateteret raskt og vipp operasjonsbrettet i en 60 graders vinkel.
Etter 30 sekunder legger du operasjonskortet flatt, og fjerner suturen bak luftrøret. Bruk deretter en 4-0 voksbelagt flettet silkesutur for å lukke hud snittet med to til tre masker. Den akutte lungeskaden som følge av intra-bronkialsyreinstillasjon involverer hele venstre lunge.
Faktisk, etter intravenøs administrering av Evans blå fargestoff og lungeperfusjon, oppdages fargestoffet bare i venstre lunge. Kvantifisering av fargestoffet ekstravasasjon i venstre lunge er betydelig økt i forhold til sham selektiv instillasjon. Interstitielle nøytrofiler akkumuleres i venstre lunge 24 timer etter syreinstillasjon i motsetning til høyre lunge der få interstitielle nøytrofiler observeres.
Lunge histologi avslører vevsskade og betennelse på organ- og cellenivå med eksudativ betennelse 24 timer etter skade som preget av markert alveolrødem og nøytrofiltrasjon i venstre lunge. Merk at mangel på betydelig skade eller leukocytttilstrømning til uskadet kontroll høyre lunge. 72 timer etter skade reduseres ødemet og cellulære infiltrater betydelig som representerer en løsende eksudativ fase.
Som vurdert ved strømningscytometri øker alveolære nøytrofiler i venstre lunge 24 timer etter den første skaden, og reduseres betydelig ved 48 og 72 timer. Det er viktig å visualisere kateteret i luftrøret før du går videre. Vinkle kanylen mot venstre mainstem bronchus under innsetting og følg syreinstillasjonen med 50 mikroliter luft.
Bronchoalveolar lavage væske analyse, lunge histologi, immuncelle fenotyping ved flyt cytometri, levende mus imaging, og lungefunksjon testing kan alle utføres for å vurdere betennelse og oppløsning. Utviklingen av denne selvbegrensede modellen av akutt lungeskade har gjort det mulig for forskere å gi betydelige bidrag til løsningsbiologien. Husk at konsentrert saltsyre er farlig og at den skal håndteres i en kjemisk hette iført riktig personlig verneutstyr.
