O método intra-brônquico seletivo é significativo porque oferece aos pesquisadores um modelo reprodutível e não letal para estudar lesões pulmonares agudas, uma das principais causas da síndrome do desconforto respiratório agudo em humanos. A vantagem da técnica intra-brônquica seletiva é a localização da resposta inflamatória ao pulmão esquerdo oferecendo o pulmão direito como um controle ileso e minimizando a angústia animal. Demonstrando esse procedimento estará Alexander Tavares, técnico e aluno de pré-graduação do nosso laboratório.
Para preparar 0,1 ácido clorídrico normal, adicione 11 mililitros de água dupla destilada a uma garrafa de vidro âmbar, seguido pela adição lenta de um mililitro de ácido normal de 37%12. Em seguida, adicione lentamente quatro mililitros de um estoque normal de ácida trabalhando em 35 mililitros duplamente destilados em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, use uma sonda eletrônica de pH para medir o pH da solução de estoque normal de 0,1, titulando-se a um pH de 1,1 usando hidróxido de sódio ou solução de estoque ácido, conforme necessário para um volume final de 40 mililitros.
Antes de iniciar o procedimento, filtre de um a dois mililitros da solução ácida através de um filtro microliter estéril de 0,22 em um tubo de microcentrífuga estéril e confirme a falta de resposta ao reflexo da dor em um rato anestesiado. Usando cortadores elétricos em golpes lentos para baixo raspe suavemente a área cirúrgica na superfície ventral do mouse abaixo do queixo na região cervical da garganta. Remova qualquer cabelo solto e cotonete a pele exposta com três soluçãos consecutivas de 10% de iodo povidone e cotonetes de álcool isopropílico de 70%.
Quando a pele estiver preparada, coloque o rato na posição supina em uma placa cirúrgica limpa e cubra o animal com uma cortina cirúrgica estéril. Faça uma abertura longitudinal de 0,5 centímetros na pele acima da traqueia e das glândulas salivares, e use fórceps serrilhados ligeiramente curvos para retrair cuidadosamente a pele. Separe suavemente as glândulas salivares para expor os músculos traqueais e use fórceps serrilhados ligeiramente curvados para afastar suavemente os músculos paratraqueais.
Provoque a fáscia ao redor da traqueia até que os anéis cartilaginosos da traqueia estejam completamente expostos, e use fórceps serrilhados totalmente curvos para afastar o tecido conjuntivo entre a retrotrachea e a retrofascia. Deslize fórceps serrilhados totalmente curvados atrás da traqueia e levante a traqueia. Uma vez que a ponta dos fórceps esteja atrás da traqueia, segure uma peça de 10 a 15 centímetros de sutura de seda trançada 4-0 com as pontas dos fórceps e puxe a sutura atrás da traqueia para que haja um comprimento uniforme em ambos os lados.
A placa cirúrgica pode ser virada para aproximar a área cirúrgica da mão dominante para os próximos passos. Em seguida, puxe suavemente as extremidades da sutura em direção ao anterior do mouse, e mantenha as extremidades no lugar. Para a canulação do brônquio da rede esquerda, exponha a agulha de um angiocateter de 24 polegadas por 3/4 polegadas e insira o lado de bipe da agulha na região interna da traqueia entre o primeiro e o segundo anéis traqueais.
Quando a ponta da agulha puder ser visualizada dentro do lúmen traqueal, solte a sutura e avance a cânula sobre a agulha para a traquea em direção ao lado posterior esquerdo do mouse. Quando as resistências se encontrarem, retire a agulha. Uma vez que a cânula esteja no lugar, segure firmemente a porta de injeção para evitar que o cateter se mude e proteja uma ponta de micropipette P-200 dentro da porta.
Em seguida, instile 50 microliters da solução de ácido normal filtrada 0.1 no cateter, seguido por um volume igual de ar. Esta etapa requer uma manipulação precisa da cânula, enquanto as vias aéreas estão obstruídas, e deve ser concluída de forma rápida e suave para restaurar o fluxo de ar adequado e minimizar os danos nas vias aéreas. Retire rapidamente o cateter e incline a placa cirúrgica em um ângulo de 60 graus.
Após 30 segundos, coloque a placa cirúrgica plana, e remova a sutura por trás da traqueia. Em seguida, use uma sutura de seda trançada revestida de cera 4-0 para fechar a incisão da pele com dois a três pontos. A lesão pulmonar aguda resultante da instilação de ácido intra-brônquico envolve todo o pulmão esquerdo.
De fato, após a administração intravenosa de corante azul evans e perfusão pulmonar, o corante é detectado apenas dentro do pulmão esquerdo. A quantificação da extravasação de corante no pulmão esquerdo é significativamente aumentada em relação à instilação seletiva falsa. Neutrófilos intersticiais se acumulam no pulmão esquerdo 24 horas após a instilação de ácido em contraste com o pulmão direito no qual poucos neutrófilos intersticiais são observados.
A histologia pulmonar revela lesão tecidual e inflamação nos níveis do órgão e celular com inflamação exudativa 24 horas após a lesão caracterizada por edema alveolar marcado e infiltração de neutrófilo dentro do pulmão esquerdo. Note que a falta de lesões significativas ou o fluxo de leucócitos no pulmão direito de controle ileso. 72 horas após a lesão, o edema e os infiltrados celulares são substancialmente diminuídos representando uma fase exsudativa de resolução.
Conforme avaliado pela citometria de fluxo, os neutrófilos alveolares aumentam no pulmão esquerdo 24 horas após a lesão inicial, e diminuem substancialmente em 48 e 72 horas. É importante visualizar o cateter na traqueia antes de avançar. Angule a cânula em direção ao brônquio da rede esquerda durante a inserção e siga a instilação ácida com 50 microliters de ar.
Análise de fluidos de lavage broncoalveolar, histologia pulmonar, fenotipagem de células imunes por citometria de fluxo, imagem de rato vivo e teste de função pulmonar podem ser realizados para avaliar a inflamação e resolução. O desenvolvimento desse modelo auto-limitado de lesão pulmonar aguda permitiu que os pesquisadores fizessem contribuições significativas para o campo da biologia da resolução. Lembre-se que o ácido clorídrico concentrado é perigoso e que deve ser manuseado em um capuz químico usando o equipamento de proteção individual adequado.
