El método intragu bronquial selectivo es significativo porque ofrece a los investigadores un modelo reproducible y no letal para el estudio de la lesión pulmonar aguda, una de las principales causas del síndrome de dificultad respiratoria aguda en humanos. La ventaja de la técnica selectiva intra bronquial es la localización de la respuesta inflamatoria al pulmón izquierdo ofreciendo el pulmón derecho como un control no lesionado y minimizando la angustia animal. Demostrar este procedimiento estará Alexander Tavares, un técnico y estudiante pregraduado en nuestro laboratorio.
Para preparar 0,1 ácido clorhídrico normal, añadir 11 mililitros de agua doble destilada a una botella de vidrio ámbar, seguido de la adición lenta de un mililitro de ácido normal al 37%12. A continuación, agregue lentamente cuatro mililitros de un caldo de trabajo ácido normal en 35 mililitros de agua destilada doble en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilice una sonda de pH electrónica para medir el pH de la solución de stock normal 0,1, valorando a un pH de 1,1 utilizando hidróxido de sodio o solución de stock ácido según sea necesario a un volumen final de 40 mililitros.
Antes de comenzar el procedimiento, filtre de uno a dos mililitros de la solución ácida a través de un filtro estéril de 0,22 microlitros en un tubo de microcentrífuga estéril y confirme la falta de respuesta al reflejo del dolor en un ratón anestesiado. El uso de pinzas eléctricas en golpes lentos hacia abajo afeite suavemente el área quirúrgica en la superficie ventral del ratón debajo de la barbilla en la región cervical de la garganta. Retire cualquier cabello suelto y frote la piel expuesta con tres solución consecutiva de 10%povidona-yodo y 70%hisopos de alcohol isopropílico.
Cuando la piel haya sido preparada, coloque el ratón en la posición supina en una tabla quirúrgica limpia y cubra al animal con una cortina quirúrgica estéril. Haz una abertura longitudinal de 0,5 centímetros en la piel por encima de la tráquea y las glándulas salivales, y usa fórceps serrados ligeramente curvados para retraer cuidadosamente la piel. Separe suavemente las glándulas salivales para exponer los músculos traqueales y use fórceps serrados ligeramente curvados para separar suavemente los músculos paratraqueales.
Elimina la fascia que rodea la tráquea hasta que los anillos cartilaginosos de la tráquea estén completamente expuestos, y usa fórceps serrados completamente curvados para trabajar el tejido conectivo entre la retrotraquea y la retrofascia. Deslice los fórceps serrados completamente curvados detrás de la tráquea y levante la tráquea. Una vez que la punta de los fórceps esté detrás de la tráquea, agarre una pieza de 10 a 15 centímetros de sutura de seda trenzada de 4-0 con las puntas de los fórceps y tire de la sutura detrás de la tráquea para que haya una longitud uniforme a cada lado.
La placa quirúrgica se puede girar para acercar el área quirúrgica a la mano dominante para los siguientes pasos. A continuación, tire suavemente de los extremos de la sutura hacia la parte anterior del ratón, y mantenga los extremos en su lugar. Para la cánula del bronquio del tronco principal izquierdo, exponga la aguja de un angiocatéter de calibre 24 por 3/4 pulgadas e inserte el lado biselado de la aguja hacia arriba en la región interior de la tráquea entre el primer y segundo anillos traqueales.
Cuando la punta de la aguja se pueda visualizar dentro del lumen traqueal, suelte la sutura y avance la cánula sobre la aguja en la traquea que se inclina hacia el lado posterior izquierdo del ratón. Cuando se encuentren resistencias, retire la aguja. Una vez que la cánula esté en su lugar, sujete firmemente el puerto de inyección para evitar que el catéter se desplace y asegure una punta de micropipeta P-200 dentro del puerto.
A continuación, infunda 50 microlitros de la solución de ácido normal 0,1 filtrada en el catéter, seguido de un volumen igual de aire. Este paso requiere una manipulación precisa de la cánula, mientras que las vías respiratorias están obstruidas, y deben completarse rápida y suavemente para restaurar el flujo de aire adecuado y minimizar el daño de las vías respiratorias. Retire rápidamente el catéter e incline la placa quirúrgica en un ángulo de 60 grados.
Después de 30 segundos, poner la placa quirúrgica plana, y quitar la sutura de detrás de la tráquea. A continuación, utilice una sutura de seda trenzada recubierta de cera 4-0 para cerrar la incisión de la piel con dos o tres puntos de sutura. La lesión pulmonar aguda resultante de la instilación del ácido intra bronquial involucra todo el pulmón izquierdo.
De hecho, después de la administración intravenosa de tinte azul Evans y perfusión pulmonar, el tinte se detecta sólo dentro del pulmón izquierdo. La cuantificación de la extravasación del tinte en el pulmón izquierdo aumenta significativamente en relación con la instilación selectiva falsa. Los neutrófilos intersticiales se acumulan en el pulmón izquierdo 24 horas después de la instilación del ácido en contraste con el pulmón derecho en el que se observan pocos neutrófilos intersticiales.
La histología pulmonar revela lesión tisular e inflamación a nivel de órganos y celulares con inflamación exudativa 24 horas después de la lesión, como se caracteriza por un edema alveolar marcado y una infiltración de neutrófilos dentro del pulmón izquierdo. Tenga en cuenta que la falta de lesión significativa o la afluencia de leucocitos en el pulmón derecho de control no lesionado. 72 horas después de la lesión, el edema y los infiltrados celulares disminuyen sustancialmente representando una fase exudativa de resolución.
Según lo evaluado por la citometría de flujo, los neutrófilos alveolares aumentan en el pulmón izquierdo 24 horas después de la lesión inicial, y disminuyen sustancialmente a las 48 y 72 horas. Es importante visualizar el catéter en la tráquea antes de avanzar. Angulo la cánula hacia el bronquio del tronco principal izquierdo durante la inserción y siga la instilación ácida con 50 microlitros de aire.
Se pueden realizar análisis de líquidos de lavado broncoalveolar, histología pulmonar, fenotipado de células inmunitarias por citometría de flujo, imágenes de ratón en vivo y pruebas de función pulmonar para evaluar la inflamación y la resolución. El desarrollo de este modelo auto limitado de lesión pulmonar aguda ha permitido a los investigadores hacer contribuciones significativas al campo de la biología de la resolución. Recuerde que el ácido clorhídrico concentrado es peligroso y que debe ser manejado en una capucha química que lleve el equipo de protección personal adecuado.
