Selektiv intra-bronkial metoden är betydande eftersom det erbjuder utredarna en reproducerbar och nonlethal modell för att studera akut lungskada, en viktig orsak till akut respiratorisk nöd syndrom hos människor. Fördelen med den selektiva intra-bronkial tekniken är lokaliseringen av den inflammatoriska svar på den vänstra lungan erbjuder rätt lunga som en oskadad kontroll och minimera djur nöd. Demonstrera denna procedur kommer att Alexander Tavares, en tekniker och pregraduate student i vårt labb.
För att förbereda 0,1 normal saltsyra, tillsätt 11 milliliter dubbeldestillerat vatten till en bärnstensfärgad glasflaska, följt av den långsamma tillsats av en milliliter av 37%12 normal syra. Därefter tillsätt långsamt fyra milliliter av en normal syra arbetslager i 35 milliliter dubbelt destillerat vatten i en 50-milliliter koniska röret. Använd sedan en elektronisk pH-sond för att mäta pH-värdet för den 0,1 normala stamlösningen, titrering till ett pH-värde på 1,1 med hjälp av natriumhydroxid eller syra stamlösning efter behov till en slutlig volym på 40 milliliter.
Innan du börjar förfarandet, filtrera en till två milliliter av syralösningen genom en steril 0,22 mikroliter filter i en steril mikrocentrifugrör och bekräfta en brist på svar på smärta reflex i en sövd mus. Använda elektriska clippers i långsam nedåtgående stroke rakar försiktigt operationsområdet på den ventrala ytan av musen under hakan i halsregionen i halsen. Ta bort eventuellt löst hår, och svabb den exponerade huden med tre på varandra följande 10%povidone-jodlösning och 70%isopropyl alkohol svabbprover.
När huden har prepped, placera musen i ryggläge på en ren kirurgisk styrelse, och täcka djuret med en steril kirurgisk drapera. Gör en längsgående 0,5 centimeter öppning i huden ovanför luftstrupen och spottkörtlarna, och använd något böjda tandade tlysor för att försiktigt dra tillbaka huden. Separera försiktigt spottkörtlarna för att exponera trakealmuskulaturen och använd lätt böjda tandade tlykningar för att försiktigt trycka isär paratrakeala musklerna.
Reta bort fascia som omger luftstrupen tills luftstrupens broskringar är helt exponerade, och använd helt böjda tandade tlyck för att arbeta bort bindväven mellan retrotrachean och retrofascia. Skjut fullt böjda tandade tlysor bakom luftstrupen och lyft luftstrupen. När spetsen på tåtorna är bakom luftstrupen, ta tag i en 10 till 15 centimeter bit 4-0 flätad siden sutur med spetsarna på tlyckor och dra suturen bakom luftstrupen så att det finns en jämn längd på vardera sidan.
Den kirurgiska styrelsen kan vändas för att föra det kirurgiska området närmare den dominerande handen för nästa steg. Dra sedan försiktigt ändarna av suturen mot musens främre, och håll ändarna på plats. För cannulation av den vänstra mainstem bronchus, exponera nålen av en 24-gauge med 3/4-tums angiocatheter och sätt nålen avfasning sida upp i den inre regionen av luftstrupen mellan den första och andra luftstrupen ringar.
När nålspetsen kan visualiseras inom luftstrupslumen, släpp suturen och för fram kanylen över nålen in i luftstrupens mete mot musens vänstra bakre sida. När motstånd påträffades, dra tillbaka nålen. När kanylen är på plats, fatta ett fast grepp om injektionsporten för att förhindra att katetern skiftar och säkrar en P-200-mikropipettespets i porten.
Sedan ingjuta 50 mikroliter av den filtrerade 0,1 normalsyralösningen i katetern, följt av en lika stor volym luft. Detta steg kräver exakt manipulering av kanylen, medan luftvägarna är hindrad, och bör slutföras snabbt och smidigt för att återställa korrekt luftflöde och för att minimera luftvägsskador. Dra snabbt tillbaka katetern och luta operationskortet i 60 graders vinkel.
Efter 30 sekunder, lägg den kirurgiska styrelsen platt, och ta bort suturen bakom luftstrupen. Använd sedan en 4-0 vaxbelagd flätad sidensutur för att stänga huden snitt med två till tre stygn. Den akuta lung skada som härrör från intra-bronkial syra instillation innebär hela vänstra lungan.
Faktum är att efter intravenös administrering av Evans blå färgämne och lungperfusion, färgämnet upptäcks endast inom den vänstra lungan. Kvantifiering av färgämnet extravasering i den vänstra lungan är betydligt ökad i förhållande till sken selektiv instillation. Interstitiell neutrophils ackumuleras i den vänstra lungan 24 timmar efter syra instillation i motsats till den högra lungan där få interstitiell neutrophils observeras.
Lung histologi avslöjar vävnad skada och inflammation på orgel och cellulära nivåer med exsudative inflammation 24 timmar efter skada som kännetecknas av markerade alveolar ödem och neutrofil infiltration inom vänster lunga. Observera att brist på betydande skada eller leukocyt tillströmning i den oskadade kontroll höger lunga. 72 timmar efter skada ödem och cellulära infiltrates är väsentligt minskade representerar en lösande exudative fas.
Som bedömts av flödescytometri, alveolära neutrofiler öka i den vänstra lungan 24 timmar efter den inledande skadan, och minska väsentligt vid 48 och 72 timmar. Det är viktigt att visualisera katetern i luftstrupen innan du avancerar. Vinkla kanylen mot vänster mainstem bronchus under insättning och följ syran instillation med 50 mikroliter luft.
Bronchoalveolar lavage vätska analys, lunga histologi, immun cell fenotypning genom flöde cytometri, levande mus imaging och pulmonell funktion testning kan alla utföras för att bedöma inflammation och upplösning. Utvecklingen av denna självbegränsade modell av akut lungskada har gjort det möjligt för forskare att göra betydande bidrag till området resolution biologi. Kom ihåg att koncentrerad saltsyra är farlig och att den ska hanteras i en kemisk huva som bär lämplig personlig skyddsutrustning.