Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af et tilskud (17172MFDS215) fra ministeriet for fødevarer og narkotika sikkerhed, National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud, der finansieres af Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og det grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).

Humane Ecfc'er blev isoleret fra humant perifert blod som beskrevet i en tidligere rapport27. Kort, det mononukleale celle lag blev adskilt fra hele blodet ved hjælp af Ficoll-Paque plus, og dyrkede i det rette medium, indtil Endothelial-lignende kolonier blev vist. Kolonier blev indsamlet og ECFCs blev isoleret ved hjælp af CD31-belagte magnetiske perler. MSCs blev isoleret fra den overtrædende mononukleare celle (MNC) fraktion af human voksen knoglemarv. Undersøgelsesprotokollen blev godkend...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

I nærværende undersøgelse indføres et forbedret in vitro-angiogeneseanalysesystem, der udnytter Co-kultursfæroider dannet af to humane vaskulære celle progenitorer, ecfcs og MSCS. co-Culture sfæroide-systemet kan efterligne in vivo vaskulær spire dannelse, opnås ved interaktion og inkorporering mellem endotelceller og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro-angiogenese-assays, der kun afspejler ECs-medieret angiogenese, er dette Co-Culture-analyse system mere repræsentativt for den multitrinskaskade af fysio...

Ca. 500.000.000 mennesker verden over forventes at drage fordel af angiogenesis-moduerende terapi for vaskulære misdannelser-associerede sygdomme som reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme, og tumor metastaser1. Således er udviklingen af lægemidler, der kontrollerer angiogenese blevet et vigtigt forskningsområde i den farmaceutiske industri. I løbet af narkotika udviklingsprocessen, in vivo dyreforsøg er nødvendig for at undersøge virkningerne af Drug kandidater på fysiologiske funktioner og systemiske interaktioner mellem organer. Etiske og omkostningsspørgsmål har imidlertid øget bekymringerne vedrørende dyreforsøg2. Der er derfor behov for forbedrede in vitro-analysesystemer for at opnå mere nøjagtige og forudsigelige data, der fører til bedre beslutningstagning før dyreforsøg. Nuværende in vitro angiogenese assays normalt måle spredning, invasion, migration, eller rørformede struktur dannelse af endotelceller (ECs) seedet i to-dimensionelle (2D) kultur plader3. Disse 2D angiogenese assays er hurtige, enkle, kvantitative og omkostningseffektive, og har i væsentlig grad bidraget til opdagelsen af angiogenese-modulerende stoffer. Der er dog stadig flere spørgsmål, som skal forbedres.
Sådanne 2D in vitro-analysesystemer kan ikke afspejle komplekse flertrinshændelser af angiogenese, der forekommer under in vivo fysiologiske forhold, hvilket fører til unøjagtige resultater, der forårsager uoverensstemmelser mellem in vitro-analysedata og kliniske forsøgsresultater4. 2D-kulturforhold inducerer også ændring af cellulære fænotyper. For eksempel, efter spredning i 2D kultur plader, ECs har en svag cellulær fænotype som manifesteret ved reduceret ekspression af CD34 og flere signaler, der regulerer cellulære svar5,6. For at overvinde begrænsningerne i 2D-kulturbaserede angiogenese-analysesystemer er tre-dimensionelle (3D) sfæriske angiogeneseanalysessystemer blevet udviklet. Spiring efterfulgt af rørformede struktur dannelse fra sfæroider dannet af ECs afspejle in vivo neo-vascularization processer7,8. Således, 3D sfæroide angiogenese assay er blevet betragtet som en effektiv analyse system til screening potentielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.
De fleste 3D sfæroide angiogenese assays udnytter kun ECs, hovedsageligt humane navle formede vene endotelceller (huvecs) eller humane dermal microvaskulære endotelceller (hdmecs) til at fokusere på den cellulære respons af ECs under angiogenese. Men, blod kapillærer er sammensat af to celletyper: ECs og pericytes. Udarbejdelse af tovejsinteraktion mellem ECs og pericytes er afgørende for korrekt vaskulær integritet og funktion. Flere sygdomme, såsom arveligt slagtilfælde, diabetisk retinopati, og venøs misdannelse, er forbundet med ændret pericyte tæthed eller nedsat pericyte fastgørelse til endotelet9. Pericytes er også kendt som et centralt element i angiogen proces. Pericytes rekrutteres til at stabilisere nydannede fartøjs strukturer ved ECs. I denne henseende, mono-kultur sfæroide angiogenese assay ikke indarbejde pericytes7,10. Derfor kan Co-Culture sfæroider dannet af ECs og pericytes give en værdifuld tilgang til mere nøje efterligne fysiologisk angiogen hændelser.
Den foreliggende undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D Co-kultur sfæriske angiogenese-assay med en kombination af humane endotel kolonidannende celler (ECFCs) og mesenchymal stamceller (MSCs) til mere nøje at afspejle in vivo angiogenese. Co-Culture sfæroide system som en in vitro-repræsentation af et normalt blodkar blev først etableret af korff et al. i 200111. De kombinerede HUVECs og humane navlestrengs glatte muskelceller (HUSMCs), og viste, at co-kultur af to modne vaskulære celler faldt spiring potentiale. Moden ECs (huvecs) er kendt for gradvist at miste deres evne til at formere sig og differentiere, hvilket negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Modne perivaskulære celler (HUSMCs) kan forårsage endotel celle inaktivering gennem ophævelse af den vaskulære endotelial vækstfaktor (VEGF) reaktionsevne11. Den væsentligste forskel mellem Korffs og vores co-Culture sfæroide-system er de anvendte celletyper. Vi anvendte to vaskulære prækursorer, ecfcs og MSCS, at etablere en ordentlig angiogenese assay system til at screene og undersøge Pro-eller-anti-angiogene agenter. ECFCs er forløberen for ECs. ECFCs har robust spredningskapacitet sammenlignet med modne ECs14, som gør det muligt at overvinde begrænsningen af ECS. Ecfcs bidrager til ny fartøjs dannelse i mange postnatale patofysiologiske tilstande15,16,17. MSCS er pluripotente stamceller, der har kapacitet til at differentiere sig til pericytes og dermed bidrage til angiogenese18,19.
I tidligere rapporter viste ecfcs og MSCS synergistiske virkninger på in vitro-rørdannelse20, in vivo neo-vascularization21,22og forbedret reperfusion af iskæmisk væv23,24. I denne undersøgelse blev ECFCs og MSCs anvendt til at danne Co-kultur sfæroider og indlejret i type I collagen gel for at afspejle et in vivo 3D miljø. Kollagen betragtes som en vigtig bestanddel af den ekstracellulære matrix (ECM) omkring ECs25. ECM spiller en afgørende rolle i reguleringen af celle adfærd26. Den analyse protokol, der foreslås her, kan nemt og hurtigt udføres inden for to dage ved hjælp af fælles laboratorieteknikker. For effektiv celle sporing under spiring proces, kan hver celletype fluorescently mærket og overvåges ved hjælp af en real-time celle optager. Det nyoprettede 3D Co-Culture sfæroide angiogenese-analyse system er designet til at øge følsomheden for at evaluere potentielle angiogene modulatorer og give forudsigelige oplysninger forud for in vivo-studiet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Undersøgelser inden for angiogenese har været aggressivt voksende i de sidste par årtier med anerkendelsen af, at angiogenese er et kendetegn for mere end 50 forskellige patologiske tilstande, såsom reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme og tumor metastaser. Under angiogenese Drug udvikling, det er afgørende at bruge in vitro-analysesystemer med passende celletyper og ordentlige forhold til at afspejle den fysiologiske angiogenese proces. For at overvinde begrænsningerne af nuværende in vitro-angiogenese-analysesystemer, der primært anvender endotelceller, udviklede vi et 3-dimensionalt (3D) sfærisk spiring-analyse system. Co-Culture sfæroider blev produceret af to humane vaskulære celle prækursorer, endotel kolonidannende celler (ecfcs) og mesenchymal stamceller (MSCS) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs sfæroider blev indlejret i type I kollagen matrix for at efterligne det in vivo ekstracellulære miljø. En real-time celle optager blev udnyttet til løbende at observere progression af angiogen spiring fra sfæroider for 24 h. levende celle fluorescerende mærkning teknik blev også anvendt til at kanal lokaliseringen af hver celletype under spire dannelse. Angiogenisk potentiale blev kvantificeret ved at tælle antallet af spirer og måle den kumulative længde af spirer genereret fra de enkelte sfæroider. Fem tilfældigt udvalgte sfæroider blev analyseret pr. forsøgsgruppe. Sammenlignings eksperimenter viste, at ECFCs + MSCs sfæroider udviste større spire nummer og kumulativ spire længde sammenlignet med kun ECFCs-sfæroider. Bevacizumab, en FDA-godkendt angiogenesehæmmer, blev testet med det nyudviklede Co-Culture sfæroide-analyse system for at verificere dets potentiale til at screene anti-angiogeniske lægemidler. IC50 -værdien for ecfcs + MSCS-sfæroider sammenlignet med Sfæroider i ecfcs var tættere på den effektive plasmakoncentration af bevacizumab opnået fra xenograft tumor musemodel. Den nuværende undersøgelse tyder på, at 3D ecfcs + MSCS sfæroide angiogenese assay system er relevant for fysiologisk angiogenese, og kan forudsige en effektiv plasmakoncentration forud for dyreforsøg.

Der blev udført sammenlignings eksperimenter ved hjælp af sfæroider med monokultur (kun ECFCs) og co-Culture spheroider (ECFCs + MSCs) for at undersøge, om MSCs spiller en betydelig rolle i ECFCs-medieret angiogenesis. Spiring dannelse fra hver sfæroide blev overvåget for 24 h af en real-time celle optager, der kunne fange progression af angiogen spiring fra sfæroider. Angiogenisk potentiale blev kvantificeret ved at tælle antallet af spirer og måle den kumulative længde af spirer genereret fra individuelle sf?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionel Co-kultur sfærisk angiogenese assay system er designet til at efterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur sfæroider er dannet af to humane vaskulære celler prækursorer, ECFCs og MSCs, og indlejret i kollagen gel. Det nye system er effektivt til at evaluere angiogene modulatorer og giver mere relevant information til in vivo-studiet.

Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Denne 3D co-kultur sfæriske system er designet til at efterligne fysiologisk angiogenese. Det vil være effektivt til at evaluere potentielle angiogene modulatorer og giver forudsigelige oplysninger forud for in vivo-undersøgelser. Dette system udnytter co-kultur sfæroider dannet af to vaskulære progenitor celler og kan bruges til at undersøge cellulære interaktioner, spiring, og den rørformede modning af fysiologisk angiogenese.Hvis vi kan bruge patientceller til at danne co-kultur sfæroider, kan vi bruge dette system til at udvikle personlige behandlinger for unormale angiogenese-relaterede sygdomme, såsom kræft. Denne analyse system kan øge følsomheden og effektiviteten af undersøgelser af angiogenese og udvikling af lægemidler. Begynd med at bruge 05 %trypsin-EDTA til at frigøre ECFC'er og MSC'er fra henholdsvis 80 til 90 % sammenflydende cellekulturer i henholdsvis tre eller fem minutter i en cellekulturinkubator.Inaktiver trypsin med frisk komplet DMEM medium, og pipette cellerne et par gange for at generere en enkelt celle suspension. Cellerne opsamres ved centrifugering efterfulgt af to vasker med serumfrit medium. Efter den anden vask fortyndes ECFC'erne til tre gange 10 til de seks celler pr. milliliter middelkoncentration og MPC'erne til to gange 10 til de seks celler pr. millimeter medium koncentration i individuelle mikrocentrifugerør med to milliliter.Pellet cellerne ved centrifugering, og omhyggeligt aspirere alle, men de sidste 15 til 25 mikroliter af supernatant fra hver celle prøve. Dernæst resuspendere hver pellet i 250 mikroliter af fortyndingsmidler C fra en fluorescerende farvestof kit, og forsigtigt pipette celle suspensioner for at sikre en fuldstændig dispersion. Der tilsættes 250 mikroliter frisklavet 20-mikromolar PKH67 til mikrofFC-røret.Tilføj 250 mikroliter af 12-mikromolar PKH26 til røret af MSCs. Bland straks begge cellesuspensioner. Efter fem minutter ved stuetemperatur med omrystning, beskyttet mod lys, stoppe farvning proces med en minut inkubation i 0,5 milliliter FBS pr rør.Ved slutningen af inkubationen opsamler cellerne ved centrifugering, og supernatanten fjernes forsigtigt efterfulgt af to milliliter frisk komplet medium pr. vask. Derefter suspenderes cellerne i respektive medium i 15-milliliterrør. For sfærisk generation fortyndes cellesuspensionerne efter den anden vask først i den passende koncentration af endotelcellevækstmedium MV2 suppleret med 20 % methylcelluloseopløsning og 5 % koncentrationen af fostrets kvægserum.Dernæst tilsættes hver celle suspension i en steriliseret polystyren rektangulært reservoir. Brug en multikanalpipette til at tilføje ca. 125 mikroliterdråber af celler på dækslet af en 150-millimeter kulturplade. Når alle cellerne er tilsat, vendes dækslet over bunden af en skål, der indeholder 15 milliliter PBS, og pladerne i cellekulturkubatoren i 24 timer.Den næste dag skylles skålen med fem milliliter PBS i et 50-milliliterrør pr. skål. Skyl dækslerne med yderligere fem milliliter PBS for at indsamle eventuelle resterende sfæroider, og pellet sfæroiderne ved centrifugering. Kassér forsigtigt alle, men de sidste 100 til 200 mikroliter supernatant, og tryk forsigtigt på rørets væg, så sfæroiderne frit er ophængt i den resterende supernatant.Der tilsættes et passende volumen af endotelcellevækstmed MV2 suppleret med 5 % føtalt kvægserum og 40%methylcelluloseopløsning til hvert rør for at resuspendere sfæroiderne ved en 100 sfæriske per milliliter medium koncentration. Brug en en-milliliter pipette spids skåret til en tre-til fem-millimeter diameter til forsigtigt at blande sfæroid suspensioner. Brug en ny bredspids, en milliliter pipette til at blande sfæroidaffjedringsopløsningen med en neutraliseret type I kollagengelgel i et en-til-en-forhold på is.Tilføj 900 mikroliter af hver sfæroide-suspension kollagen gel opløsning i brøndene i en forvarperet 24-brønd plade. Lad suspensionerne polymerisere i 30 minutter i cellekulturinkubatoren, før de dækker sfæroiderne med 100 mikroliter af endotelcellevækstmedium MV2 suppleret med 2,5 % FBS og 50 nanogram pr. milliliter VEGF til de ECFC-kun-sfæriske kulturer og medium suppleret med FBS til MSC og ECFC-plus-MSC-spheroide kulturer. Derefter placere hver plade i en real-time celle optager installeret i en celle kultur inkubator, og tilfældigt fokusere på fem til 10 sfæroider på en 10x forstørrelse til at overvåge spiring dannelse af hver fluorescens-mærket sfæroide hver time i 24 timer.For at kvantificere spheroid spiring, importere billedfilerne til ImageJ, og måle antallet og længden af spirer udtrykke passende fluorescerende signal fra fem tilfældigt udvalgte sfæroider pr eksperimentel gruppe. For ECFC-plus-MSC-sfæroider er antallet af spirer og den kumulative spirelængde betydeligt højere sammenlignet med antallet af ECFC-kun-sfæroider på alle tidspunkter. MSCs-only sfæroider danner ikke spirer, men demonstrerer en individuel migration af MSC uden for sfæroider.Mærkningen af ECFC med grøn-fluorescerende farvestof og MSC med rød-fluorescerende farvestof, før kombineres for at generere ECFC-plus-MSC sfæroider viser, at ECFC-medieret spire strukturer er dækket med MSC' er, hvilket tyder på, at kombinerede MSC'er fungerer som perivascular celler under spiredannelse, øge spire stabilitet og holdbarhed ved den tætte sammenhæng mellem to vaskulære celler. ECFC-plus-MSC sfæroider forbehandlet med en angiogenese hæmmer viser en nedsat spire antal og en kumulativ spire længde i en dosis-afhængig måde i forhold til kontrol ECFC-plus-MSC sfæroider. I parallelle forsøg viser ECFC-kun-spheroider, der er forbehandlet med inhibitoren efterfulgt af stimulering med VEGF, også et nedsat vækstfaktorinduceret spirenummer og akkumuleret spirelængde på en dosisafhængig måde.Bemærk, at en højere koncentration af angiogenese hæmmer er nødvendig for at hæmme ECFC-plus-MSC sfæroider sammenlignet med ECFC-only sfæroider. Tumorvækst er signifikant hæmmet i høj dosis angiogenese inhibitor-behandlede dyr i forhold til både kontrol-behandlede dyr og lav dosis angiogenese inhibitor-behandlede dyr i en human xenograft tumor mus model. Plasmakoncentrationen af bevacizumab hos højdosisbehandlede mus var 568 plus eller minus 40,62 mikrogram pr. milliliter, hvilket var tættere på IC50-værdien af bevacizumab for at hæmme kumulativ spirelængde i ECFC-plus-MSC-spheroider i stedet for ECFC-only-spheroider.Dette tyder på, at ECFC-plus-MSC co-culture spheroid system er egnet til at forudsige effektive plasmakoncentrationer forud for et dyreforsøg. Ved hjælp af en bred spids, one-mL pipette til forsigtigt at blande sfæroider, mens de er i kollagen gel på is er vigtigt for at beskytte integriteten af sfæroider. Vi kan ændre dette system til at indføre andre celletyper såsom immunceller og andre ekstracellulære matricer til at undersøge celle-matrix krydstale under angiogenese.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Overførsel af mammakirteldannende evne mellem mammale basale epithelceller og mammale luminale celler via ekstracellulære vesikler / eksosomer

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring Co kultur Assay: Et praktisk værktøj til at vurdere angiogene af mesenchymale stromale celler In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Afledning og differentiering af Canine æggestokkene mesenkymale stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...