Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av et stipend (17172MFDS215) fra departementet for mat og narkotika sikkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2016R1A6A1A03007648).

Human ECFCs ble isolert fra humant perifert blod som beskrevet i en tidligere rapport27. Kort, mononukleære celle laget ble skilt fra hele blodet ved hjelp av Ficoll-Paque Plus, og kultivert i riktig medium til de endothelial koloniene ble vist. Kolonier ble samlet og ECFCs ble isolert ved hjelp av CD31-belagte magnetiske perler. MSCs ble isolert fra tilhenger mononukleære celle (MNC) brøkdel av menneskelig voksen benmarg. Studien protokollen ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangen st...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

Den nåværende studien introduserer en forbedret in vitro angiogenese analysen system utnytte co-kultur spheroids dannet av to menneskelige vaskulær celle forfedre, ECFCs og MSCs. co-kultur spheroid systemet kan etterligne in vivo vaskulær spire formasjon, som er oppnås ved samhandling og innlemmelse mellom endothelial celler og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro angiogenese analyser som reflekterer bare ECs-mediert angiogenese, denne co-kultur analysen systemet er mer representativt for flertrinns kaskade av...

Ca 500 000 000 mennesker over hele verden er forventet å dra nytte av angiogenese-modulerende terapi for vaskulær misdannelse-assosiert sykdommer som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer, og tumor metastasering1. Dermed har utviklingen av legemidler som kontrollerer angiogenese blitt et viktig forskningsområde i farmasøytisk industri. Under narkotika utviklingsprosessen er in vivo dyrestudier nødvendig for å undersøke virkningene av narkotika kandidater på fysiologiske funksjoner og systemiske interaksjoner mellom organene. Men etiske og kostnads spørsmål har økt bekymringene vedrørende dyre eksperimenter2. Derfor, forbedret in vitro analysen systemer er nødvendig for å oppnå mer nøyaktige og forutsigbare data som fører til bedre beslutningstaking før dyr eksperimenter. Current in vitro angiogenese analyser vanligvis måle spredning, invasjon, migrasjon, eller rørformede struktur dannelse av endothelial celler (ECs) seeded i to-dimensjonale (2D) kultur plater3. Disse 2D angiogenese analysene er raske, enkle, kvantitative og kostnadseffektive, og har i betydelig grad bidratt til oppdagelsen av angiogenese-modulerende narkotika. Men flere problemer gjenstår å bli bedre.
Slike 2D in vitro-analysen systemer kan ikke reflektere komplekse flertrinns hendelser av angiogenese som oppstår i in vivo fysiologiske forhold, fører til unøyaktige resultater som forårsaker avvik mellom in vitro-analysen data og klinisk utprøving utfall4. 2D kultur forhold også indusere endring av cellulære fenotyper. For eksempel, etter spredning i 2D kultur plater, ECs har en svak mobilnettet fenotype som manifestert ved redusert uttrykk for CD34 og flere signaler som regulerer cellulære responser5,6. For å overvinne begrensningene i 2D kultur-baserte angiogenese analysen systemer, tredimensjonale (3D) spheroid angiogenese analysen systemer har blitt utviklet. Spirende etterfulgt av rørformede struktur dannelse fra spheroids dannet av ECs reflektere in vivo neo-endometrial blodkar prosesser7,8. Dermed har 3D spheroid angiogenese analysen blitt betraktet som en effektiv analysen system for screening potensielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.
Høyst 3D spheroid angiogenese analyser anvende bare ECs, hovedsakelig Human navle vene endothelial celler (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulær endothelial celler (HDMECs) å fokusere mot det cellular svaret av ECs i løpet av angiogenese. Men blodkar består av to celletyper: ECs og pericytes. Utarbeide toveis interaksjon mellom ECs og pericytes er avgjørende for riktig vaskulær integritet og funksjon. Flere sykdommer, som arvelig slag, diabetiker retinopati, og venøs misdannelse, er assosiert med endret pericyte tetthet eller redusert pericyte vedlegg til endotelet9. Pericytes er også kjent som et nøkkelelement i angiogenic prosessen. Pericytes er rekruttert for å stabilisere nyopprettede fartøy strukturer av ECs. I denne forbindelse, mono-kultur spheroid angiogenese analysen ikke innlemme pericytes7,10. Derfor co-kultur spheroids dannet av ECs og pericytes kan gi en verdifull tilnærming til tettere etterligne fysiologiske angiogenic hendelser.
Den nåværende studien tok sikte på å utvikle en 3D co-kultur spheroid angiogenese analysen med en kombinasjon av menneskelig endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) til nærmere reflektere in vivo angiogenese. Co-kultur spheroid system som en in vitro representasjon montering av en normal blodkar ble først etablert av korff et al. i 200111. De kombinerte HUVECs og menneskelige navle arterien glatte muskelceller (HUSMCs), og demonstrerte at co-kultur av to modne vaskulære celler redusert spirende potensialet. Eldre ECs (HUVECs) er kjent for å gradvis miste sin evne til å spre og differensiere, noe som negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Eldre inflammasjon celler (HUSMCs) kan forårsake endothelial celle deaktivering gjennom opphevelsen av vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) respons11. Den største forskjellen mellom korff ' s og vår co-kultur spheroid systemet er celle typene som brukes. Vi brukte to vaskulære forløpere, ECFCs og MSCs, å etablere en skikkelig angiogenese analysen system til skjermen og undersøke Pro-eller-anti-angiogenic agenter. ECFCs er forløperen til ECs. ECFCs har robust sprednings kapasitet sammenlignet med eldre ECs14, som gjør det mulig å overvinne begrensningen av ECS. ECFCs bidrar til nye fartøy dannelse i mange postnatal patofysiologisk forhold15,16,17. MSCs er Pluripotent stamceller som har kapasitet til å differensiere til pericytes, og dermed bidra til angiogenese18,19.
I tidligere rapporter, ECFCs og MSCs viste synergieffekter på in vitro tube formasjon20, in vivo neo-endometrial blodkar21,22, og forbedret reperfusion av iskemiske vev23,24. I denne studien, ECFCs og MSCs ble brukt til å danne co-kultur spheroids og innebygd i type I kollagen gel å reflektere en in vivo 3D miljø. Kollagen regnes som en stor bestanddeler av ekstracellulære matrise (ECM) rundt ECs25. ECM spiller en avgjørende rolle i å regulere celle atferden26. Analysen protokollen foreslås her kan enkelt og raskt utført innen to dager ved hjelp av vanlige laboratorie teknikker. For effektiv celle sporing under spirende prosessen, kan hver celle type bli fluorescensmerkete merket og overvåkes ved hjelp av en sanntids celle opptaker. Det ny-etablerte 3D tilpasse-kulturen spheroid angiogenese analysen system er beregnet på forhøye følsomheten for vurderer muligheter angiogenic modulatorer og å skaffe forutsigbar beskjed på forhånd av inne vivo studere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Studier innen angiogenese har vært aggressivt økende i de siste ti årene med erkjennelsen av at angiogenese er et kjennetegn på mer enn 50 ulike patologiske tilstander, slik som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer , og tumor metastasering. Under angiogenese narkotika utvikling, er det avgjørende å bruke in vitro analysen systemer med aktuelle celletyper og riktige forhold for å gjenspeile fysiologiske angiogenese prosessen. For å overvinne begrensninger av gjeldende in vitro angiogenese analysen systemer ved hjelp av hovedsakelig endothelial celler, utviklet vi en 3-dimensjonal (3D) co-kultur spheroid spirende analysen system. Co-kultur spheroids ble produsert av to menneskelige vaskulær celle forløpere, endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs spheroids ble innebygd i type I kollagen matrise å etterligne in vivo ekstracellulære miljø. En sanntids celle opptaker ble benyttet for å kontinuerlig observere progresjon av angiogenic spirende fra spheroids for 24 h. live celle fluorescerende merkingsteknikker ble også brukt på tarmkanalen lokalisering av hver celle type under spire formasjon. Angiogenic potensiale ble kvantifisert ved å telle antall spirer og måle den kumulative lengden av spirer generert fra den enkelte spheroids. Fem tilfeldig valgte spheroids ble analysert per eksperimentell gruppe. Sammenligning eksperimenter viste at ECFCs + MSCs spheroids viste større spire tall og kumulativ spire lengde sammenlignet med ECFCs-bare spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkjent angiogenese inhibitor, ble testet med den nylig utviklede co-kultur spheroid analysen system for å verifisere potensialet til skjermen anti-angiogenic narkotika. IC50 -verdien for ECFCs + MSCs-spheroids sammenlignet med ECFCs-Only-spheroids var nærmere den effektive plasmakonsentrasjonen av bevacizumab Hentet fra xenograft tumor musemodell. Den nåværende studien tyder på at 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese analysesystem er relevant for fysiologiske angiogenese, og kan forutsi en effektiv Plasmakonsentrasjon i forkant av dyre eksperimenter.

Sammenligning eksperimenter ble utført ved hjelp av mono-kultur spheroids (ECFCs-Only) og co-kultur spheroids (ECFCs + MSCs) for å undersøke om MSCs spille en betydelig rolle i ECFCs-mediert angiogenese. Spirende formasjon fra hver spheroid ble overvåket i 24 timer av en sanntids celle opptaker som kunne fange progresjon av angiogenic spirende fra spheroids. Angiogenic potensiale ble kvantifisert ved å telle antall spirer og måle den kumulative lengden av spirer generert fra individuelle spheroids. Fem tilfeldig va...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensjonal co-kultur spheroid angiogenese analysen systemet er utformet for å etterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur spheroids er dannet av to menneskelige vaskulære celle forløpere, ECFCs og MSCs, og innebygd i kollagen gel. Det nye systemet er effektivt for å evaluere angiogenic modulatorer, og gir mer relevant informasjon til in vivo studien.

Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Dette 3D co-kultur sfæroid systemet er designet for å etterligne fysiologisk angiogenese. Det vil være effektivt for evaluering av potensielle angiogene modulatorer og gir forutsigbar informasjon i forkant av in vivo-studier. Dette systemet benytter co-kultur sfæroider dannet av to vaskulære stamceller og kan brukes til å undersøke cellulære interaksjoner, spirende, og tubulær modning av fysiologisk angiogenese.Hvis vi kan bruke pasientceller til å danne co-kultur sfæroider, kan vi bruke dette systemet til å utvikle personlige behandlinger for unormale angiogeneserelaterte sykdommer, som kreft. Dette analysesystemet kan øke følsomheten og effektiviteten til studier av angiogenese og legemiddelutvikling. Begynn med å bruke 05 % trypsin-EDTA til å koble fra ECFCer og msCer fra henholdsvis 80 til 90 % sammenføyde cellekulturer i henholdsvis tre eller fem minutter i en cellekulturinkubator.Inaktiver trypsin med friskt komplett DMEM medium, og pipette cellene et par ganger for å generere en enkelt celle suspensjon. Samle cellene ved sentrifugering, etterfulgt av to vasker med serumfritt medium. Etter den andre vasken fortynner ECFCs til en tre ganger 10 til de seks cellene per milliliter middels konsentrasjon og MSCene til to ganger 10 til de seks cellene per millimeter middels konsentrasjon i individuelle to milliliter mikrocentrifugerør.Pellet cellene ved sentrifugering, og forsiktig aspirere alle unntatt de siste 15 til 25 mikroliter av supernatant fra hver celleprøve. Deretter bruker du hver pellet i 250 mikroliter fortynningsvæske C fra et fluorescerende fargesett, og pipetter forsiktig cellesuspensjonene for å sikre fullstendig spredning. Tilsett 250 mikroliter nylaget 20 mikromos PKH67 i røret av ECFCer.Tilsett 250 mikroliter med 12-mikromolar PKH26 i røret av MSCer. Bland umiddelbart begge cellesuspensjonene. Etter fem minutter ved romtemperatur med risting, beskyttet mot lys, stopp fargeprosessen med ett minutts inkubasjon i 0,5 milliliter FBS per rør.På slutten av inkubasjonen, samle cellene ved sentrifugering, og fjern forsiktig supernatanten, etterfulgt av to vasker i to milliliter friskt komplett medium per vask. Deretter suspenderer cellene i respektive medium i 15-milliliter rør. For sfæroidgenerering, etter den andre vasken, må cellesuspensjonene først fortynnes i riktig konsentrasjon av endotelcellevekstmedium MV2 supplert med 20 % metylcelluloseoppløsning og 5 % føtal storfeserumkonsentrasjon.Deretter legger du hver celle suspensjon i et sterilisert polystyren rektangulært reservoar. Bruk en flerkanals pipette til å legge til ca. 125 mikroliter dråper celler på forsiden av en 150 millimeter kulturplate. Når alle cellene er lagt til, inverter dekselet over bunnen av en tallerken som inneholder 15 milliliter PBS, og plasser platene i cellekulturinkubatoren i 24 timer.Neste dag, skyll paraboldekslene med fem milliliter PBS i ett 50-milliliter rør per tallerken. Skyll dekslene med ytterligere fem milliliter PBS for å samle eventuelle gjenværende sfæroider, og pellet spheroidene ved sentrifugering. Kast forsiktig alle unntatt de siste 100 til 200 mikroliter av supernatant, og trykk forsiktig på veggen av røret slik at spheroidene er fritt suspendert i de resterende supernatant.Tilsett riktig volum av endotelcellevekst medium MV2 supplert med 5% fostervin serum og 40% metylcellulose løsning til hvert rør for å gjenbruke sfæroider på en 100 sfæroider per milliliter middels konsentrasjon. Bruk en en-milliliter pipettespiss kuttet til en tre til fem millimeter diameter for å forsiktig blande spheroid suspensjoner. Bruk en ny bredspiss, en-milliliter pipette til å blande spheroid suspensjonsløsningen med en nøytralisert type I kollagengel i ett-til-en-forhold på is.Tilsett 900 mikroliter av hver sfæroid-suspendere kollagen gel løsning i brønnene av en forvarmet 24-brønns plate. La suspensjonene polymerisere i 30 minutter i cellekulturinkubatoren, før du dekker spheroider med 100 mikroliter av endotelcellevekst medium MV2 supplert med 2,5% FBS og 50 nanograms per milliliter VEGF til ECFC-bare sfæroider og medium supplert med FBS bare til MSC og ECFC-plus-MSC sfæroider. Plasser deretter hver plate i en sanntidscelleopptaker installert i en cellekulturinkubator, og fokuser tilfeldig på fem til 10 sfæroider ved en 10x forstørrelse for å overvåke spirende dannelse av hver fluorescens-merket sfæroid hver time i 24 timer.For å kvantifisere sfæroidspiren, importer bildefilene til ImageJ, og mål antall og lengde på spirer som uttrykker riktig fluorescerende signal fra fem tilfeldig utvalgte sfæroider per eksperimentell gruppe. For ECFC-plus-MSC-sfæroider er antall spirer og kumulativ spirelengde betydelig høyere sammenlignet med de av ECFC-bare sfæroider til enhver tid. Sfæroider kun for msc danner ikke spirer, men viser en individuell migrering av MSC utenfor sfæroider.Merkingen av ECFC med grønn-fluorescerende fargestoff og MSC med rød-fluorescerende fargestoff før kombinere for å generere ECFC-plus-MSC sfæroider viser at ECFC-medierte spirestrukturer er dekket med MSCer, noe som tyder på at kombinerte MSCer fungerer som perivascular celler under spiredannelse, noe som forbedrer spirestabilitet og holdbarhet ved den stramme forbindelsen mellom to vaskulære celler. ECFC-plus-MSC-sfæroider som er forbehandlet med en angiogenesehemmer, viser et redusert spirenummer og en kumulativ spirelengde på en doseavhengig måte sammenlignet med kontroll av ECFC-plus-MSC-sfæroider. I parallelle eksperimenter, ECFC-bare sfæroider forbehandlet med hemmeren etterfulgt av stimulering med VEGF viser også en redusert vekstfaktor-indusert spire nummer og kumulativ spire lengde på en doseavhengig måte.Merk at en høyere konsentrasjon av angiogenesehemmer er nødvendig for å hemme ECFC-plus-MSC-sfæroider sammenlignet med ECFC-bare sfæroider. Tumorvekst er betydelig hemmet i høy dose angiogenese hemmere behandlet dyr sammenlignet med både kontroll-behandlet dyr og lav dose angiogenese inhibitor-behandlet dyr i en menneskelig xenograft tumor mus modell. Plasmakonsentrasjonen av bevacizumab hos høydosebehandlede mus var 568 pluss eller minus 40,62 mikrogram per milliliter, som var nærmere IC50-verdien av bevacizumab for å hemme kumulativ spirelengde i ECFC-plus-MSC-sfæroider i stedet for ECFC-bare sfæroider.Dette tyder på at ECFC-plus-MSC co-kultur sfæroid systemet er egnet for å forutsi effektive plasmakonsentrasjoner i forkant av en dyrestudie. Ved hjelp av en bredspiss er en ml pipette for å forsiktig blande spheroidene mens de er i kollagengel på is viktig for å beskytte integriteten til sfæroidene. Vi kan endre dette systemet for å introdusere andre celletyper som immunceller og andre ekstracellulære matriser for å undersøke cellematrise crosstalk under angiogenese.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Overføring av Mammary Gland-forming Ability Mellom Mammary Basal Epithelial Cells og Mammary Luminal Cells Via Extracellular Vesicles / Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring co kultur analysen: Et praktisk verktøy for å vurdere Angiogenic potensialet av Mesenchymal Stromal celler In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Avledning og differensiering av hjørnetann Ovarian Mesenchymal stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...