Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por una subvención (17172MFDS215) del Ministerio de Seguridad Alimentaria y de Drogas, la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de CienciaS Básicas a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del National Research Foundation of Korea(NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2016R1A6A1A03007648).

Los EFCC humanos se aislaron de la sangre periférica humana, como se describe en un informe anterior27. Brevemente, la capa de células mononucleares fue separada de toda la sangre usando el Ficoll-Paque Plus, y cultivada en el medio adecuado hasta que aparecieron las colonias endoteliales. Se recogieron colonias y se aislaron los EFC utilizando perlas magnéticas recubiertas de CD31. Los MSC se aislaron de la fracción de células mononucleares adherentes (MNC) de la médula ósea adulta humana....

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

El presente estudio introduce un sistema de ensayo de angiogénesis in vitro mejorado utilizando esferoides de cocultivo formados por dos progenitores de células vasculares humanas, EFCC y MSC. interacción e incorporación entre células endoteliales y pericítas. En comparación con otros ensayos de angiogénesis in vitro que reflejan sólo la angiogénesis mediada por los CE, este sistema de ensayo de cocultura es más representativo de la cascada multipaso de angiogénesis fisiológica, incluida la interacción celu...

Se espera que aproximadamente 500 millones de personas en todo el mundo se beneficien de la terapia moduladora de la angiogénesis para enfermedades asociadas a la malformación vascular, como la artritis reumatoide, la oculopatía, las enfermedades cardiovasculares y la metástasis tumoral1. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que controlan la angiogénesis se ha convertido en un importante área de investigación en la industria farmacéutica. Durante el proceso de desarrollo de fármacos, es necesario estudiar en animales in vivo para explorar los efectos de los candidatos a fármacos en las funciones fisiológicas y las interacciones sistémicas entre los órganos. Sin embargo, las cuestiones éticas y de costos han aumentado las preocupaciones con respecto a los experimentos con animales2. Por lo tanto, se necesitan sistemas de ensayo in vitro mejorados para obtener datos más precisos y predecibles que conduzcan a una mejor toma de decisiones antes de los experimentos con animales. Los ensayos actuales de angiogénesis in vitro suelen medir la proliferación, invasión, migración o formación de estructura tubular de células endoteliales (EC) sembradas en placas de cultivo bidimensionales (2D)3. Estos ensayos de angiogénesis 2D son rápidos, simples, cuantitativos y rentables, y han contribuido significativamente al descubrimiento de fármacos moduladores de angiogénesis. Sin embargo, quedan varias cuestiones por mejorar.
Estos sistemas de ensayo in vitro 2D no pueden reflejar eventos complejos de angiogénesis en varios pasos que se producen en condiciones fisiológicas in vivo, lo que conduce a resultados inexactos que causan discrepancias entre los datos de ensayo in vitro y los resultados de los ensayos clínicos4. Las condiciones de cultivo 2D también inducen el cambio de fenotipos celulares. Por ejemplo, después de la proliferación en placas de cultivo 2D, los ECs tienen un fenotipo celular débil como se manifiesta por la expresión reducida de CD34 y varias señales que rigen las respuestas celulares5,6. Para superar las limitaciones de los sistemas de ensayo de angiogénesis basados en cultivos 2D, se han desarrollado sistemas de ensayo de angiogénesis esferoide tridimensionales (3D). La formación de la estructura tubular a partir de esferoides formados por eCs refleja los procesos de neovascularización in vivo7,8. Por lo tanto, el ensayo de angiogénesis esferoide 3D se ha considerado un sistema de ensayo eficaz para la detección de posibles fármacos pro o anti-angiogénesis.
La mayoría de los ensayos de angiogénesis esferoide 3D utilizan únicamente eCs, principalmente células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) o células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMC) para centrarse en la respuesta celular de las EC durante la angiogénesis. Sin embargo, los capilares sanguíneos se componen de dos tipos de células: eCs y pericitas. La elaboración de la interacción bidireccional entre los eCs y los pericitas es fundamental para la correcta integridad y función vascular. Varias enfermedades, como el accidente cerebrovascular hereditario, la retinopatía diabética y la malformación venosa, se asocian con una densidad de pericita alterada o una disminución de la unión pericita al endotelio9. Pericytes también se conocen como un elemento clave del proceso angiogénico. Los pericíticos son reclutados para estabilizar las estructuras de buques recién formados por las CE. En este sentido, el ensayo de angiogénesis esferoide monocultivo no incorpora pericitos7,10. Por lo tanto, los esferoides cocultivoformados por eCs y pericitas pueden proporcionar un enfoque valioso para imitar más estrechamente los eventos angiogénicos fisiológicos.
El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de angiogénesis esferoide cocultivo 3D con una combinación de células formadoras de colonias endoteliales humanas (ECFC) y células madre mesenquimales (MSC) para reflejar más de cerca la angiogénesis in vivo. El sistema esferoide de cocultura como un conjunto de representación in vitro de un vaso sanguíneo normal fue establecido por primera vez por Korff et al. en 200111. Combinaron HUVECs y células musculares lisas de la arteria umbilical humana (HMM), y demostraron que el cocultivo de dos células vasculares maduras disminuyó el potencial de brotación. Se sabe que las EC maduras (HUVEC) pierden progresivamente su capacidad de proliferar y diferenciar, lo que afecta negativamente a sus respuestas de angiogénesis12,13. Las células perivasculares maduras (HusMC) pueden causar inactivación de células endoteliales a través de la abrogación de la capacidad de respuesta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)11. La principal diferencia entre Korff y nuestro sistema de esferoides de cocultura son los tipos de células utilizados. Aplicamos dos precursores vasculares, los FCFC y los MSC, para establecer un sistema de ensayo de angiogénesis adecuado para examinar e investigar agentes pro-o-anti-angiogénicos. Los FCFC son el precursor de las CE. Los FCFC tienen una capacidad de proliferación sólida en comparación con los CEmaduros 14,lo que permite superar la limitación de los CE. Los FCFC contribuyen a la formación de nuevos buques en muchas condiciones fisiopatologías post-natales15,16,17. Los MSC son células madre pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en pericitos, contribuyendo así a la angiogénesis18,19.
En informes anteriores, los FCFC y los MSC mostraron efectos sinérgicos en la formación de tubos in vitro20, in vivo neo-vascularización21,22, y mejor reperfusión de tejidos isquémicos23,24. En el presente estudio, los EFCC y los MSC se utilizaron para formar esferoides de cocultura e incrustados en gel de colágeno tipo I para reflejar un entorno 3D in vivo. El colágeno se considera como un componente importante de la matriz extracelular (ECM) que rodea a los CE25. El ECM desempeña un papel crítico en la regulación del comportamiento celular26. El protocolo de ensayo propuesto aquí se puede llevar a cabo fácil y rápidamente en un plazo de dos días utilizando técnicas de laboratorio comunes. Para un seguimiento eficaz de las celdas durante el proceso de brotación, cada tipo de celda se puede etiquetar fluorescentemente y supervisarse mediante una grabadora de celdas en tiempo real. El sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea de cocultivo 3D recientemente establecido está diseñado para aumentar la sensibilidad para evaluar posibles moduladores angiogénicos y proporcionar información predecible antes del estudio in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Estudios en el campo de la angiogénesis han ido creciendo agresivamente en las últimas décadas con el reconocimiento de que la angiogénesis es un sello distintivo de más de 50 condiciones patológicas diferentes, como artritis reumatoide, oculopatía, enfermedades cardiovasculares , y metástasis tumoral. Durante el desarrollo de fármacos de angiogénesis, es crucial utilizar sistemas de ensayo in vitro con tipos celulares adecuados y condiciones adecuadas para reflejar el proceso fisiológico de angiogénesis. Para superar las limitaciones de los sistemas actuales de ensayo de angiogénesis in vitro utilizando principalmente células endoteliales, desarrollamos un sistema de ensayo de brote de esferoides de cocultivo tridimensional (3D). Los esferoides de cocultivo fueron producidos por dos precursores de células vasculares humanas, células formadoras de colonias endoteliales (EFC) y células madre mesenquimales (MSC) con una proporción de 5 a 1. Los esferoides ECFCs+MSCs se incrustaron en la matriz de colágeno de tipo I para imitar el entorno extracelular in vivo. Se utilizó un grabador celular en tiempo real para observar continuamente la progresión de la brotación angiogénica de esferoides durante 24 h. La técnica de etiquetado fluorescente de células vivas también se aplicó para tratar la localización de cada tipo de célula durante la formación de brotes. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de los brotes generados a partir de los esferoides individuales. Se analizaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. Los experimentos de comparación demostraron que los esferoides de eCFCs+MSC mostraron un mayor número de brotes y una longitud de brote acumulativa en comparación con los esferoides solo de eFCCs. Bevacizumab, un inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA, fue probado con el sistema de ensayo esferoide de cocultivo recientemente desarrollado para verificar su potencial para detectar fármacos antiangiogénicos. El valoric 50 para los esferoides de ECFCs+MSC en comparación con los esferoides solo de eFCC sin lugar a la concentración plasmática efectiva de bevacizumab obtenida del modelo de ratón tumor xenoinjerto. El presente estudio sugiere que el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea 3D ECFCs+MSCs es relevante para la angiogénesis fisiológica, y puede predecir una concentración plasmática efectiva antes de experimentos con animales.

Los experimentos de comparación se realizaron utilizando esferoides monocultivos (solo EFCC) y esferoides de cocultura (ECFCs+MSCs) para examinar si los MSC desempeñan un papel considerable en la angiogénesis mediada por los FCFC. La formación de brotes de cada esferoide fue monitoreada durante 24 horas por un grabador celular en tiempo real que podía capturar la progresión de la brotación angiogénica de esferoides. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acum...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Este sistema esferoide de co-cultivo 3D está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Será eficaz para evaluar los moduladores angiogénicos potenciales y proporciona información predecible antes de los estudios in vivo. Este sistema utiliza esferoides de co-cultivo formados por dos células progenitoras vasculares y se puede utilizar para investigar las interacciones celulares, la brotación, y la maduración tubular de la angiogénesis fisiológica.Si podemos utilizar células de pacientes para formar esferoides de co-cultivo, podemos utilizar este sistema para desarrollar tratamientos personalizados para enfermedades anormales relacionadas con la angiogénesis, como el cáncer. Este sistema de ensayo puede aumentar la sensibilidad y la eficiencia de los estudios de angiogénesis y desarrollo de fármacos. Comience por usar 05%trypsin-EDTA para separar los ECFC y los MSC de 80 a 90%cultivos celulares confluentes durante tres o cinco minutos en una incubadora de cultivo celular, respectivamente.Inactivar la trippsina con un medio DMEM completo y pipetear las células varias veces para generar una sola suspensión de células. Recoger las células por centrifugación, seguido de dos lavados con medio libre de suero. Después del segundo lavado, diluir los ECFC a tres veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media y los MSC a dos veces 10 a las seis células por milímetro de concentración media en tubos de microcentrífuga individuales de dos mililitros.Pelecila las células por centrifugación, y aspirar cuidadosamente todas menos las últimas 15 a 25 microlitros de sobrenadante de cada muestra de célula. A continuación, resuspender cada pellet en 250 microlitros de diluyente C de un kit de tinte fluorescente, y pipetear suavemente las suspensiones celulares para asegurar una dispersión completa. Añadir 250 microlitros de 20 micromolares PKH67 recién preparados al tubo de ECFC.Añadir 250 microlitros de 12 micromolar PKH26 al tubo de MSC. Mezclar inmediatamente ambas suspensiones celulares. Después de cinco minutos a temperatura ambiente con agitación, protegido de la luz, detenga el proceso de tinción con una incubación de un minuto en 0,5 mililitros de FBS por tubo.Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación, y retirar cuidadosamente el sobrenadante, seguido de dos lavados en dos mililitros de medio fresco completo por lavado. Luego suspenda las células en el medio respectivo en tubos de 15 mililitros. Para la generación de esferoides, después del segundo lavado, primero diluir las suspensiones celulares en la concentración adecuada de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 20%solución de celulosa metilo y 5%concentración sérica bovina fetal.A continuación, agregue cada suspensión celular en un depósito rectangular de poliestireno esterilizado. Utilice una pipeta multicanal para añadir aproximadamente gotas de 125 microlitro de células a la cubierta de una placa de cultivo de 150 milímetros. Cuando se hayan añadido todas las células, invierta la cubierta sobre la parte inferior de un plato que contenga 15 mililitros de PBS, y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.Al día siguiente, enjuague las cubiertas de los platos con cinco mililitros de PBS en un tubo de 50 mililitros por plato. Enjuague las cubiertas con cinco mililitros adicionales de PBS para recoger los esferoides restantes, y pelete los esferoides por centrifugación. Deseche cuidadosamente todos los últimos 100 a 200 microlitros de sobrenadantes, y toque suavemente en la pared del tubo para que los esferoides se suspendan libremente en el sobrenadante restante.Añadir el volumen adecuado de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 5%suero bovino fetal y 40%solución de celulosa de metilo a cada tubo para resuspender los esferoides a 100 esferoides por mililitro de concentración media. Utilice una punta de pipeta de un mililitro cortada a un diámetro de tres a cinco milímetros para mezclar suavemente las suspensiones de esferoides. Utilice una nueva pipeta de punta ancha de un mililitro para mezclar la solución de suspensión de esferoides con un gel de colágeno neutralizado tipo I en una proporción de uno a uno sobre hielo.Agregue 900 microlitros de cada solución de gel de colágeno que suspenda el esferoides en los recipientes de una placa precalerada de 24 pozos. Permitir que las suspensiones se polimericen durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular, antes de cubrir los esferoides con 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales MV2 complementados con 2.5%FBS y 50 nanogramos por mililitro de VEGF a los esferoides solo ECFC y medio complementado con FBS sólo para los cultivos de esferoides MSC y ECFC-plus-MSC. A continuación, coloque cada placa en un grabador celular en tiempo real instalado en una incubadora de cultivo celular, y concéntrese aleatoriamente en cinco a 10 esferoides en un aumento de 10x para monitorear la formación de brotes de cada esferoide con etiqueta de fluorescencia cada hora durante 24 horas.Para cuantificar la brotación del esferoide, importe los archivos de imagen a ImageJ y mida el número y la longitud de los brotes expresando la señal fluorescente adecuada de cinco esferoides seleccionados aleatoriamente por grupo experimental. Para los esferoides ECFC-plus-MSC, el número de brotes y la longitud acumulada del brote son significativamente mayores en comparación con los de los esferoides solo ECFC en todos los puntos de tiempo. Los esferoides solo MSCs no forman brotes, sino que demuestran una migración individual del MSC fuera de los esferoides.El etiquetado de ECFC con tinte verde-fluorescente y MSC con tinte rojo-fluorescente antes de combinarse para generar esferoides ECFC-plus-MSC demuestra que las estructuras de brotes mediados por ECFC están cubiertas con MSC, lo que sugiere que los MSC combinados funcionan como células perivasculares durante la formación de brotes, mejorando la estabilidad y durabilidad del brote mediante la estrecha asociación entre dos células vasculares. Los esferoides ECFC-plus-MSC pretratados con un inhibidor de la angiogénesis muestran una disminución del número de brotes y una longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control de los esferoides ECFC-plus-MSC. En experimentos paralelos, los esferoides solo ECFC pretratados con el inhibidor seguidos de estimulación con VEGF también demuestran una disminución del número de brotes inducidos por el factor de crecimiento y la longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis.Cabe destacar que se necesita una mayor concentración de inhibidores de la angiogénesis para inhibir los esferoides ECFC-plus-MSC en comparación con los esferoides solo ECFC. El crecimiento tumoral se inhibe significativamente en animales tratados con inhibidores de la angiogénesis en dosis altas en comparación con animales tratados con control y animales tratados con inhibidores de la angiogénesis de baja dosis en un modelo de ratón tumoral de xenoinjerto humano. La concentración plasmática de bevacizumab en ratones tratados con dosis altas fue de 568 más o menos 40,62 microgramos por mililitro, que estaba más cerca del valor IC50 de bevacizumab para inhibir la longitud acumulada del brote en esferoides ECFC-plus-MSC en lugar de esferoides solo ECFC.Esto sugiere que el sistema de esferoides de co-cultivo ECFC-plus-MSC es adecuado para predecir concentraciones plasmáticas efectivas antes de un estudio en animales. El uso de una pipeta de punta ancha de un ml para mezclar suavemente los esferoides mientras están en gel de colágeno sobre hielo es importante para proteger la integridad de los esferoides. Podemos modificar este sistema para introducir otros tipos de células como células inmunitarias y otras matrices extracelulares para investigar la interferencia de la matriz celular durante la angiogénesis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...