Name: three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Bu araştırma, Gıda ve İlaç Güvenliği Bakanlığı'ndan (17172MFDS215) bir hibe, Kore hükümeti (MSIP) (2017R1A2B4005463) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı(NRF) hibesi ve Temel Bilim Araştırma Programı ile desteklenmiştir. Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) (2016R1A6A1A03007648).

İnsan ECFC'leri bir önceki raporda açıklandığı gibi insan periferik kan izole edildi27. Kısaca, mononükleer hücre tabakası Ficoll-Paque Plus kullanılarak tüm kandan ayrıldı ve endotel benzeri koloniler ortaya çıkana kadar uygun ortamda kültürlendi. Koloniler toplandı ve ECFC'ler CD31 kaplı manyetik boncuklar kullanılarak izole edildi. MSC'ler insan yetişkin kemik iliğinin yapışık mononükleer hücre (MNC) fraksiyonundan izole edildi. Çalışma protokolü Duksung Kadın ...

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells.">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li><li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro.">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting.">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li><li>Gaengel, K., Genov&#233;, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis.">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li><li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension.">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li><li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model:+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness.">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li><li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic,+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells.">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li><li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis.">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis.">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li><li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+haematopoietic+stem+cells:+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy.">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li><li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp.">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis.">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li><li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li><li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion.">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li><li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats.">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li><li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle.">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).</li><li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling:+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment.">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li><li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+a+dynamic+niche+in+cancer+progression.">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment.">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).</li><li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells.">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li></ol>

Bu çalışmada, iki insan vasküler hücre atası, ECFC ve MSC'lerden oluşan eş kültür sploroidlerini kullanan geliştirilmiş bir in vitro anjiyogenez titreşme sistemi ortaya konmuştur. endotel hücreleri ve perisitler arasındaki etkileşim ve birleşme ile gerçekleştirilir. Sadece EC'ler aracılı anjiyogenezi yansıtan diğer in vitro anjiyogenez tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu eş-kültür tahlil sistemi hücresel etkileşim, filizlenme, tüp oluşumu da dahil olmak üzere fizyolojik anjiyog...

Dünya çapında yaklaşık 500 milyon kişinin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar ve tümör metastazı gibi vasküler malformasyonla ilişkili hastalıklar için anjiyogenez modüle edici tedaviden yararlanmasıbeklenmektedir. Böylece, anjiyogenezi kontrol eden ilaçların gelişimi ilaç endüstrisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. İlaç geliştirme sürecinde, in vivo hayvan çalışması, ilaç adaylarının organlar arasındaki fizyolojik fonksiyonlar ve sistemik etkileşimler üzerindeki etkilerini araştırmak için gereklidir. Ancak, etik ve maliyet sorunları hayvan deneyleri ile ilgili endişeleri artmıştır2. Bu nedenle, hayvan deneyleri öncesinde daha iyi karar verme için daha doğru ve öngörülebilir veri elde etmek için geliştirilmiş in vitro araştırma sistemleri gereklidir. Mevcut in vitro anjiyogenez tahlilleri genellikle iki boyutlu (2D) kültür plakaları3tohumlu endotel hücrelerinin (ECs) çoğalma, invazyon, göç veya tübüler yapı oluşumunu ölçmek . Bu 2D anjiyogenez tahlilleri hızlı, basit, kantitatif ve uygun maliyetlidir ve anjiyogenez modüle edici ilaçların keşfine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Ancak, bazı sorunlar geliştirilmeye devam etmektedir.
Bu tür 2D in vitro tahnit sistemleri in vivo fizyolojik koşullarda meydana gelen anjiyogenezin karmaşık çok aşamalı olaylarını yansıtamaz, bu da in vitro tahssonucu verileri ile klinik deney sonuçları arasında tutarsızlıklara neden olan yanlış sonuçlara yol açar4. 2B kültür koşulları da hücresel fenotiplerin değişimine neden olur. Örneğin, 2B kültür plakalarında çoğalma sonra, ECs CD34 azaltılmış ifade ve hücresel yanıtları yöneten çeşitli sinyaller ile tezahür zayıf bir hücresel fenotip var5,6. 2D kültür tabanlı anjiyogenez test sistemlerinin sınırlamalarını aşmak için üç boyutlu (3D) spheroid anjiyogenez test sistemleri geliştirilmiştir. EC'lerin oluşturduğu küresel yapı oluşumunu takip eden filizlenme, vivo neo-vaskülarizasyon süreçlerini yansıtır7,8. Böylece, 3D spheroid anjiyogenez tsay potansiyel pro- veya anti-anjiyogenez ilaçları tarama için etkili bir kontrol sistemi olarak kabul edilmiştir.
En 3D spheroid anjiyogenez tahlilleri sadece ECs kullanmak, özellikle insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs) veya insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs) anjiyogenez sırasında ECs hücresel yanıt odaklanmak için. Ancak, kan kılcal damarları iki hücre tipioluşur: ECs ve perisitler. EC'ler ve perisitler arasındaki çift yönlü etkileşimin ayrıntılı olarak detaylandırılması uygun vasküler bütünlük ve fonksiyon için çok önemlidir. Kalıtsal inme, diyabetik retinopati ve venöz malformasyon gibi çeşitli hastalıklar, değişmiş perisit yoğunluğu veya endotel 9 perisit eki azalmış ileilişkilidir. Perisitler de anjiyojenik sürecin önemli bir unsuru olarak bilinir. Perisitler ECs tarafından yeni oluşan damar yapıları stabilize etmek için işe alınır. Bu bağlamda, mono-kültür sheroid anjiyogenez tsay perisit7dahil değildir,10. Bu nedenle, EC'ler ve perisitler tarafından oluşturulan eş-kültür spheroids daha yakından fizyolojik anjiyojenik olayları taklit değerli bir yaklaşım sağlayabilir.
Bu çalışmada, insan endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) bir kombinasyonu ile 3Boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez analizi nin vivo anjiyogenezi daha yakından yansıtması amaçlandı. Normal bir kan damarının in vitro temsil montaj olarak Co-kültür küresel sistem ilk Korff ve ark. tarafından 200111yılında kurulmuştur. Onlar HUVECs ve insan göbek arter düz kas hücreleri (HUSMCs) kombine ve iki olgun vasküler hücrelerin co-kültür filizlenme potansiyelini azalttığını gösterdi. Olgun ECs (HUVECs) giderek çoğalmak ve ayırt etmek için yeteneklerini kaybetmek bilinmektedir, hangi olumsuz onların anjiyogenez yanıtları etkiler12,13. Olgun perivasküler hücreler (HUSMCs) vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) duyarlılık11abrogation yoluyla endotel hücre inaktivasyonuna neden olabilir. Korff'un ve ortak kültür küresel sistemimiz arasındaki temel fark kullanılan hücre tipleridir. Pro-veya anti-anti-anjiogenik ajanları taramak ve araştırmak için uygun bir anjiyogenez testi sistemi kurmak için iki vasküler öncül, ECFC ve MsC uyguladık. ECFC'ler, EC'lerin öncüsütür. ECFC'ler, AC'lerin sınırlamasının üstesinden gelmeyi sağlayan olgun EC14ile karşılaştırıldığında sağlam çoğalma kapasitesine sahiptir. ECFCs birçok doğum sonrası patofizyolojik koşullarda yeni damar oluşumuna katkıda15,16,17. MSC'ler perisitlere ayırma kapasitesine sahip pluripotent kök hücrelerdir, bu nedenle anjiyogenez18,19.
Önceki raporlarda, ECFCs ve MSCs in vitro tüp oluşumu üzerinde sinerjik etkileri gösterdi20, in vivo neo-vaskülarizasyon21,22, ve iskemik dokuların geliştirilmiş reperfüzyon23,24. Bu çalışmada, ECFCs ve MSCs co-kültür spheroids oluşturmak için kullanılan ve in vivo 3D ortamı yansıtmak için tip I kollajen jel gömülü. Kollajen, ECs25'içevreleyen hücre dışı matriks (ECM) önemli bileşenleri nden biri olarak kabul edilir. ECM hücre davranışı26düzenleyen kritik bir rol oynar. Burada önerilen test protokolü, ortak laboratuvar teknikleri kullanılarak iki gün içinde kolayca ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Filizlenme işlemi sırasında etkili hücre takibi için, her hücre türü floresan olarak etiketlenebilir ve gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılarak izlenebilir. Yeni kurulan 3D eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi potansiyel anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde duyarlılığı artırmak ve in vivo çalışma öncesinde öngörülebilir bilgi sağlamak için tasarlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="708">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.05 % Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bevacizumab</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td>Commercial name: Avastin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dulbecco Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">11885-084</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">21600-010</td>
			<td>PBS (10X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered saline (1X)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">21-031-CVR</td>
			<td>PBS (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Endothelial cell Growth medium MV2 kit</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-22121</td>
			<td>ECGM-MV2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Atlas</td>
			<td style="width:161px;">FP-0500A</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gelatin</td>
			<td style="width:123px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:161px;">214340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine&#8211;Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10378-016</td>
			<td>GPS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Mesenchymal stem cell growth medium-2</td>
			<td style="width:123px;">Promocell</td>
			<td style="width:161px;">C-28009</td>
			<td>MSCGM-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI26</td>
			<td>PKH26</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">MINI67</td>
			<td>PKH67</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Type I collagen gel</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Vascular endothelial growth factor A</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:161px;">293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional angiogenesis assay system using co-culture spheroids formed by endothelial colony forming cells and mesenchymal stem cells

Anjiyogenez alanındaki çalışmalar, anjiyogenezin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar gibi 50'den fazla farklı patolojik hastalığın bir özelliği olduğunun kabulüyle son birkaç on yılda agresif bir şekilde büyümektedir. ve tümör metastazı. Anjiyogenez ilaç gelişimi sırasında, fizyolojik anjiyogenez sürecini yansıtmak için uygun hücre tipleri ve uygun koşullara sahip in vitro dosay sistemleri kullanmak çok önemlidir. Mevcut in vitro anjiyogenez istinat sistemlerinin esas olarak endotel hücreleri kullanılarak sınırlandırılmasını aşmak için 3 boyutlu (3D) eş kültür spheroid filizlenme saji sistemi geliştirdik. Co-kültür spheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, endotel kolonioluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücreler (MsCs) 5-1 oranı ile üretildi. ECFCs +MSCs spheroids in vivo ekstrasellüler ortamı taklit etmek için tip I kollajen matris içine gömülü idi. 24 saat boyunca küresel leşmişlerden anjiyojenik filizlenmenin ilerlemesini sürekli olarak gözlemlemek için gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılmıştır. Anjiyojenik potansiyel, filiz sayısı nın sayılarak ve bireysel küresel lerden üretilen filizlerin kümülatif uzunluğunun ölçülmesiyle ölçüldü. Deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel analiz yapıldı. Karşılaştırma deneyleri, ECFCs+MSCs spheroidlerinin ecfcs'e özgü küresel lere göre daha fazla filiz sayısı ve kümülatif filiz uzunluğu gösterdiğini göstermiştir. Bevacizumab, BIR FDA onaylı anjiyogenez inhibitörü, anti-anjiyojenik ilaçlar tarama potansiyelini doğrulamak için yeni geliştirilen co-kültür küresel test sistemi ile test edildi. ECFCs+MSCs sferoidler için IC50 değeri, ecfcs'e özel küresel sferoidlere göre ksenogreft tümör fare modelinden elde edilen bevacizumab'ın etkili plazma konsantrasyonuna daha yakındı. Bu çalışma, 3D ECFCs+MSCs sferoid anjiyogenez tsay sisteminin fizyolojik anjiyogenez ile ilgili olduğunu ve hayvan deneyleri öncesinde etkili bir plazma konsantrasyonunu öngörebildiği düşündürmektedir.

Karşılaştırma deneyleri, MsC'lerin ECFC'ler aracılı anjiyogenezde önemli bir rol oynayıp oynamadığını incelemek için mono-kültür küreseloidleri (yalnızca ECFC'ler) ve eş kültür küreselleri (ECFCs+MSCs) kullanılarak yapılmıştır. Her küresel oidden filizlenme oluşumu, küresel lerden anjiyojenik filizlenmenin ilerlemesini yakalabilen gerçek zamanlı bir hücre kaydedici tarafından 24 saat boyunca izlendi. Anjiyojenik potansiyel, filiz sayısı nın sayılarak ve bireysel küresel lerden üreti...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Bu 3D eş-kültür küresel sistem fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Potansiyel anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkili olacak ve in vivo çalışmalar öncesinde öngörülebilir bilgi sağlar. Bu sistem iki vasküler ata hücresi tarafından oluşturulan ortak kültür spheroids kullanır ve hücresel etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir, filizlenme, ve fizyolojik anjiyogenez tübüler olgunlaşma.Eğer hasta hücrelerini eş-kültür sferoidleri oluşturmak için kullanabilirsek, bu sistemi kanser gibi anormal anjiyogenezle ilgili hastalıklar için kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek için kullanabiliriz. Bu tisme sistemi anjiyogenez ve ilaç geliştirme çalışmalarının duyarlılığını ve verimliliğini artırabilir. ECFC'leri ve MSC'leri hücre kültürü eksplanında sırasıyla üç veya beş dakika boyunca %80 ila %90 eşzamanlı hücre kültürlerinden ayırmak için %05 tripsin-EDTA kullanarak başlayın.Taze tam DMEM ortamı ile tripsin inaktive ve tek bir hücre süspansiyonoluşturmak için birkaç kez hücreleri pipet. Santrifüj ile hücreleri toplamak, serum içermeyen orta ile iki yıkAma takip. İkinci yıkamadan sonra, ECFC'leri mililitre başına altı hücreye kadar üç kez 10'a, MSC'leri ise iki kat 10'a, tek tek iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde orta konsantrasyonun milimetrebaşına altı hücresine seyreltin.Santrifüj ile hücreleri pelet ve dikkatle her hücre örneğinden supernatant supernatant son 15-25 mikrolitre hariç tüm aspire. Daha sonra, floresan boya kitinden 250 mikrolitre dilüent C'deki her bir peleti yeniden askıya alın ve tam bir dağılım sağlamak için hücre süspansiyonlarını hafifçe pipetlendirin. ECFC tüpüne taze hazırlanmış 20 mikromolar PKH67 250 mikrolitre ekleyin.MSC'lerin tüpüne 250 mikrolitre 12 mikromolar PKH26 ekleyin. Titreme ile oda sıcaklığında beş dakika sonra, ışıktan korunmuş, tüp başına FBS 0,5 mililitre bir dakikalık kuluçka ile boyama işlemini durdurun.Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant kaldırmak, yıkama başına taze tam orta iki mililitre iki yıkama takip. Daha sonra 15 mililitrelik tüplerde ilgili ortamda hücreleri askıya. Küresel nesil için, ikinci yıkamadan sonra, ilk endotel hücre büyüme orta MV2 uygun konsantrasyonda hücre süspansiyonları seyreltmek 20% metil selüloz solüsyonu ve% 5 fetal sığır serum konsantrasyonu ile desteklenmektedir.Sonra, sterilleştirilmiş polistiren dikdörtgen rezervuar içine her hücre süspansiyon ekleyin. 150 milimetrelik bir kültür plakasının kapağına yaklaşık 125 mikrolitrelik hücre damlacıkları eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Tüm hücreler eklendiğinde, kapağı 15 mililitre PBS içeren bir kabın altına ters çevirin ve plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Ertesi gün, çanak başına bir 50 mililitrelik tüp içine PBS beş mililitre ile kapsar durulayın. Kalan küresel leri toplamak için kapakları beş mililitre PBS ile durulayın ve spekütaitleri santrifüjle peletlayın. Son 100 ila 200 mikrolitre supernatant hariç tümünü dikkatlice atın ve tüplerin kalan süpernatantta serbestçe asılı kalması için tüpün duvarına hafifçe dokunun.Orta konsantrasyonmili litre başına 100 sferoidler de sferoidler resuspend için her tüp için% 5 fetal sığır serum ve% 40 metil selüloz çözeltisi ile desteklenen endotel hücre büyüme orta MV2 uygun hacmi ekleyin. Küresel süspansiyonları hafifçe karıştırmak için üç ila beş milimetre çapında kesilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Küresel süspansiyon çözeltisini nötralize tip I kollajen jelile buz üzerinde bire bir oranında karıştırmak için yeni bir geniş uçlu, bir mililitrelik pipet kullanın.Önceden ısıtılmış 24 kuyulu bir plakanın kuyularına her küresel askılı kollajen jel çözeltisinin 900 mikrolitresini ekleyin. Süspansiyonlar hücre kültürü kuluçka 30 dakika polimerize izin, endotel hücre büyüme orta MV2 100 mikrolitre ile küresel kaplamaönce ECFC sadece spheroids VEGF mililitre başına 50 nanogram ve orta SADECE MSC ve ECFC-plus-MS spoid kültürlere FBS ile takviye. Sonra bir hücre kültürü kuluçka yüklü bir gerçek zamanlı hücre kaydedici her plaka yerleştirin ve rasgele 24 saat boyunca her floresan etiketli spheroid her saat filizlenme oluşumunu izlemek için 10x büyütme beş ila 10 küresel odaklanmak.Küresel filizlenmeyi ölçmek için görüntü dosyalarını ImageJ'e aktarın ve deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel yıldızdan uygun floresan sinyali ifade eden filizlerin sayısını ve uzunluğunu ölçün. ECFC-plus-MSC küreseloidler için, filiz ve kümülatif filiz uzunluğu sayısı tüm zaman noktalarında ECFC sadece küresel olanlara göre önemli ölçüde daha yüksektir. MSCs sadece küresel ler filiz formu değil, sferoidler dışında MSC bireysel bir göç göstermektedir.ECFC'nin yeşil floresan boya ve MSC ile kırmızı floresan boya ile etiketlemesi, ECFC-artı-MSC spheroids oluşturmak için birleştirilmeden önce, ECFC aracılı filiz yapılarının MFC'lerle kaplı olduğunu göstererek, filiz oluşumu sırasında kombine MSC'lerin perivasküler hücreler olarak işlev göremez, filiz kararlılığını ve dayanıklılığını iki vasküler hücre arasındaki sıkı ilişki ile artırır. Anjiyogenez inhibitörü ile ön tedavi edilen ECFC-plus-MSC spheroids, ECFC-plus-MSC küresel oidleri kontrol etmek le karşılaştırıldığında doza bağlı bir şekilde azalmış filiz sayısı ve kümülatif filiz uzunluğu göstermektedir. Paralel deneylerde, VEGF ile uyarılma takip inhibitör ile öntedavi ECFC-sadece sheroidler de bir azalma büyüme faktörü kaynaklı filiz sayısı ve doza bağımlı bir şekilde kümülatif filiz uzunluğu göstermektedir.Ekfc artı-MSC küreseloidleri inhibe etmek için sadece ECFC'ye özgü küresel sfheroidlere göre daha yüksek bir anjiyogenez inhibitörü konsantrasyonuna ihtiyaç vardır. İnsan ksenogreft tümör fare modelinde hem kontrol ile tedavi edilen hayvanlara hem de düşük doz anjiyogenez inhibitörü ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla yüksek doz anjiyogenez inhibitörü ile tedavi edilen hayvanlarda tümör büyümesi anlamlı olarak inhibe edilmektedir. Yüksek dozda tedavi edilen farelerde bevacizumab plazma konsantrasyonu 568 artı veya mililitre başına eksi 40.62 mikrogram, ecfc artı-MSC sferoidler yerine ECFC-plus-MSC sferoidler kümülatif filiz uzunluğu inhibe için bevacizumab IC50 değerine daha yakın oldu ECFC-sadece sferoidler.Bu, ECFC artı-MSC eş kültür küresel sisteminin bir hayvan çalışması öncesinde etkili plazma konsantrasyonlarını tahmin etmek için uygun olduğunu göstermektedir. Geniş uçlu, tek mL pipet kullanarak spheroids yavaşça onlar buz üzerinde kollajen jel iken karıştırmak için spheroids bütünlüğünü korumak için önemlidir. Bu sistemi, anjiyogenez sırasında hücre-matma çapraz konuşmayı araştırmak için bağışıklık hücreleri ve diğer hücre dışı matrisler gibi diğer hücre tiplerini tanıtmak için değiştirebiliriz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Gelişim Biyolojisi

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...