Name: a method to study de novo formation of chromatin domains
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Л. Валеса, Д. Озата и Х. Моу за пересмотр рукописи. D.R. Lab поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза и Национальными институтами здравоохранения (R01CA199652 и R01NS100897).

Поколение индуцируемого EED спасательных mESCs
1. Культура клеток
<ol><li>Используйте feeder-free C57BL/6 мыши эмбриональных стволовых клеток (mESCs), обладающих застойно интегрированных TransERT2 трансген, который может перемещаться в ядро при администрации 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Domains:+An+Important+Facet+of+Genome+Regulation.">Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation.</a> Bioessays. 39 (12), (2017).</li><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life.">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li><li>Holoch, D., Margueron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Regulating+PRC2+Recruitment+and+Enzymatic+Activity.">Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+polycomb-group+silencing.">Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).</li><li>Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methyltransferase+activity+associated+with+a+human+multiprotein+complex+containing+the+enhancer+of+zeste+protein.">Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein.</a> Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).</li><li>Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+enhancer+of+Zeste/ESC+complexes+have+a+histone+H3+methyltransferase+activity+that+marks+chromosomal+Polycomb+sites.">Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites.</a> Cell. 111 (2), 185-196 (2002).</li><li>M&#252;ller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methyltransferase+activity+of+a+Drosophila+Polycomb+group+repressor+complex.">Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex.</a> Cell. 111 (2), 197-208 (2002).</li><li>Ferrari, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb-Dependent+H3K27me1+and+H3K27me2+Regulate+Active+Transcription+and+Enhancer+Fidelity.">Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity.</a> Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).</li><li>Margueron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+polycomb+protein+EED+in+the+propagation+of+repressive+histone+marks.">Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks.</a> Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).</li><li>Oksuz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Onset+of+PRC2-Mediated+Repressive+Domain+Formation.">Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation.</a> Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).</li><li>Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk1/2+activity+promotes+chromatin+features+and+RNAPII+phosphorylation+at+developmental+promoters+in+mouse+ESCs.">Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs.</a> Cell. 156 (4), 678-690 (2014).</li><li>Oksuz, O., Tee, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+chromatin+modifications+in+response+to+ERK+signaling.">Probing chromatin modifications in response to ERK signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).</li><li>Benchling for Academics. Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2018)</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Zhang, Z., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase-mediated+inversion+using+lox66+and+lox71:+method+to+introduce+conditional+point+mutations+into+the+CREB-binding+protein.">Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein.</a> Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).</li><li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ChIP-Seq+normalization+reveals+global+modulation+of+the+epigenome.">Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome.</a> Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Descostes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPSeqSpike:+ChIP-Seq+data+scaling+according+to+spike-in+control.">ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control.</a> R package version 1.2.1. , (2019).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>. UCSC Genome Browser Home Available from: <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu">https://genome.ucsc.edu</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells.">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid,+Reversible,+and+Tunable+Method+to+Regulate+Protein+Function+in+Living+Cells+Using+Synthetic+Small+Molecules.">A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li><li>H&#248;jfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2.">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li></ol>

Мощный подход к пониманию механистических деталей во время формирования данного домена хроматина, заключается в том, чтобы сначала нарушить домен, а затем отслеживать его реконструкцию в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время во время реконструкции, чтобы детально пр?...

Эукариотические геномы хорошо организованы и изменения в доступностихроматина непосредственно контролируют транскрипцию генов 1. Геном содержит различные типы хроматиновых доменов, которые коррелируют с транскрипционной активностью и сроками репликации2,3. Эти хроматиндометы варьируются в размерах от нескольких килобаз (кб) до более чем 100 кб и характеризуются обогащением в различных модификациях гистона4. Главные вопросы: как формируются эти области и как они распространяются?
Один из наиболее хорошо охарактеризованных хроматина доменов поощряется через деятельность Поликомб репрессивного комплекса 2 (КНР2). КНР2 представляет собой многофункциональный комплекс, состоящий из подмножества Polycomb Group (PcG) белков5,6, и катализирует моно-, ди- и триметилирование лизина 27 гистон H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 связаны с репрессивным состоянием хроматина, но функция H3K27me1 неясна6,11. Один из основных компонентов PRC2, эмбрионального развития эктодерма (EED), связывает с конечным продуктом PRC2 катализ, H3K27me3, через его ароматические клетки, и эта функция приводит к аллостерической стимуляции PRC212,13. Ферментативная активность КНР2 имеет решающее значение для сохранения клеточной идентичности во время развития, так какнеуместное выражение определенных генов развития, которые противопоказаны для определенной линии, было бы пагубным 5,6 . Таким образом, распутывание механизмов, с помощью которых КНР2 способствует формированию репрессивных хроматинов у млекопитающих имеет основополагающее значение для понимания клеточной идентичности.
Все прошлые экспериментальные системы, предназначенные для исследования образования доменов хроматина, включая PRC2-опосредованные домены хроматина, были выполнены в условиях устойчивого состояния, которые не в состоянии отслеживать разворачивающиеся события образования доменов хроматина в Клетки. Здесь мы представляем подробный протокол для создания индуцируемой клеточной системы, которая отслеживает первоначальный набор и распространение хроматина доменов. В частности, мы фокусируемся на отслеживании формирования PRC2-опосредованных репрессивных доменов хроматина, которые составляют H3K27me2/3. Эта система, которая может захватить механистические детали образования доменов хроматина, может быть адаптирована для включения других областей хроматина, таких как широко изученные домены, включающие либо H2AK119ub или H3K9me. В сочетании с геномикой и технологиями визуализации, этот подход имеет потенциал для успешного решения различных, ключевых вопросов в биологии хроматина.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1045">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)</td>
			<td style="width:317px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">H7904-5MG</td>
			<td style="width:368px;">For induction of EED expression</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)</td>
			<td style="width:317px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:101px;">15710</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:317px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:101px;">21985-023</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2% Gelatin Solution</td>
			<td style="width:317px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G1393-100ml</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Accutase 500 ML</td>
			<td style="width:317px;">Innovative Cell Tech/FISHER</td>
			<td style="width:101px;">AT 104-500</td>
			<td>For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:317px;">Jackson immunoresaerch</td>
			<td style="width:101px;">711-585-152</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Aqua-Mount Mounting Medium</td>
			<td style="width:317px;">FISHER/VWR</td>
			<td style="width:101px;">41799-008</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td>
			<td style="width:317px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:101px;">177445PK</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg</td>
			<td style="width:317px;">Life Tech</td>
			<td style="width:101px;">D1306</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ERK inhibitor, PD0325901</td>
			<td style="width:317px;">Stemgent</td>
			<td style="width:101px;">04-0006</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Millipore/Fisher</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS Stem Cell Qualified</td>
			<td style="width:317px;">Atlanta</td>
			<td style="width:101px;">S10250</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:317px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2611L</td>
			<td>For Donor template cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GSK3 inhibitor, CHIR99021</td>
			<td style="width:317px;">Stemgent</td>
			<td style="width:101px;">04-0004</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB</td>
			<td style="width:317px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:101px;">9728S</td>
			<td>Antibody for ChIP-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">H3K27me3</td>
			<td style="width:317px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:101px;">9733S</td>
			<td>Antibody for ChIP-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Histone H2Av antibody (pAb)</td>
			<td style="width:317px;">Active motif</td>
			<td style="width:101px;">39715</td>
			<td>Spike-in control for ChIP-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:317px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">10829-018</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:317px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G7513</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:317px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">11668019</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">MangoTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:317px;">Bioline</td>
			<td style="width:101px;">BIO-21079</td>
			<td>For Genotyping PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Normal donkey serum (10 mL)</td>
			<td style="width:317px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:101px;">017-000-121</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:317px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:101px;">P0781</td>
			<td style="width:368px;">For mESCs culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td>
			<td style="width:317px;">Addgene</td>
			<td style="width:101px;">48138</td>
			<td style="width:368px;">For gRNA cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td style="width:317px;">Lucigen</td>
			<td style="width:101px;">QE0905T</td>
			<td style="width:368px;">For Genotyping PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:317px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:317px;">Thermo Fisher</td>
			<td>K270020</td>
			<td>For Donor template cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers/gBlocks</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EED-KO-gRNA-1</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EED-KO-gRNA-2</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EED-gRNA-inducible</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">i-WT-r Donor</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EED-gRNA-inducible</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:259px;">i-MT-r Donor</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:368px;">https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genotyping Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gnt-EED-KO-FW-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gnt-EED-KO-REV-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inducible_Genotype-FW-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inducible_Genotype-REV-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inducible_Genotype-FW-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Inducible_Genotype-REV-2</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to study de novo formation of chromatin domains

Организация и структура доменов хроматина уникальны для отдельных клеточных линий. Их неправильное регулирование может привести к потере клеточной идентичности и/или болезни. Несмотря на огромные усилия, наше понимание формирования и распространения хроматина по-прежнему ограничено. Хроматин домены были изучены в условиях стабильного состояния, которые не способствуют после первоначальных событий во время их создания. Здесь мы представляем метод индуцирования хроматинов доменов и следовать их реформированию как функции времени. Хотя, сперва приложенное к случаю PRC2-опосредованного репрессивного образования домена chromatin, оно смогло легко быть приспособлено к другим доменам хроматина. Модификация и/или сочетание этого метода с геномикой и технологиями визуализации предоставит бесценные инструменты для детального изучения создания доменов хроматина. Мы считаем, что этот метод произведет революцию в нашем понимании того, как хроматины образуют и взаимодействуют друг с другом.

Общая схема условной спасательной системы На рисунке 1 показана схема таргетинга для условного спасения клеток EED KO с помощью WT или клетки-мутанта (Y365A) EED, который выражается в эндогенном локусе EED. После выбивания EED, основной подразделение PRC2, что имеет важное ...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains at JoVE.com

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

Метод изучения де Ново Формирование хрометинов доменов

Этот метод предназначен для последующего формирования PRC2-опосредованных доменов хроматина в клеточных линиях, и метод может быть адаптирован ко многим другим системам.

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Мы наметим систему оценки динамического формирования хроматинов. Мы используем эту систему для того чтобы последовать за набором и распространять доменов хроматина PRC2-опосредованного в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время для анализа происходящих событий.Эта система может быть направлена на мониторинг динамических изменений в любом данном клеточном процессе и, следовательно, не ограничивается отслеживанием формирования хроматина домена. Начните с разработки руководства РНК для удаления exon 10 и 11 эндогенной копии эмбрионального развития эктодерма, или EED, в эмбриональных стволовых клетках мыши с помощью инструмента CRISPR Design Tool. Клонировать руководство РНК в CRISPR/Cas9 плазмид в соответствии с рукописными указаниями.В формате шести хорошо пластины, transfect 200,000 мыши эмбриональных стволовых клеток, или mESCs, с одним микрограммом каждого руководства РНК с использованием трансфекционных реагентов в соответствии с инструкциями производителя. Изменение мультимедиа через 24 часа после трансфекции. Через два дня после трансфекции изолируйте GFP-положительные ячейки с помощью FACS.Эффективность трансфекции колеблется от 10 до 30%, поэтому сортируют около 500 000 ячеек, чтобы захватить достаточное количество GFP-положительных ячеек для покрытия. Плита изолированных GFP-положительных клеток в 15-сантиметровые пластины, которые предварительно покрыты 0,1%gelatin для колонии сбора. Выращивать клетки в среде ESC в течение примерно одной недели до тех пор, пока отдельные колонии видны, убедившись, что изменить средства массовой информации каждые два дня.Выберите минимум 48 колоний с помощью 20-микролитровый пипетка отзыв соскребать над колонией во время аспирации. Не разбивая колонию на одиночные клетки, перенесите ее на аккутазы, содержащие 96-колодец пластины. Инкубировать колонии при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы разобщить клетки.Затем добавьте 200 микролитров СРЕДСТВ ESC к каждой колодец с многоканальной пипеткой. Хорошо перемешать и пластины клеток в две отдельные 96-хорошо пластин. Используйте одну из пластин для генотипирования, и держать другой растет до генотипирования заключен.Извлекайте ДНК из пластины с помощью коммерческих реагентов и следуя указаниям производителя. Используйте genotyping грунтовки, которые охватывают удаленный сайт для выполнения генотипирования ПЦР с Taq ДНК полимеразы. Наблюдайте продукт дна более низкого молекулярного веса в клетках с homozygous удалением по отношению к одичалым клеткам типа.Дизайн руководство РНК ввести разрез в интроне после exon 9 EED с помощью инструмента дизайна CRISPR, и клонировать его в CRISPR / Cas9 плазмид в соответствии с рукописными направлениями. Дизайн донорского шаблона ДНК, который включает в себя последовательность EED cDNA после exon 9 и C-терминал Флаг-HA тег вверх по течению от T2A-GFP последовательности, все в обратной ориентации в отношении эндогенной последовательности генов. Фланг кассеты с сращивания-прием и полиаденилирования последовательность вложенных между гетерологических перевернутых локсP сайтов, и включают в себя по крайней мере 500 базовых пар гомологии оружия с каждого конца.Разделите шаблон донора на два сегмента фрагментов генов gBlocks и соберите их в вектор PCR Blunt с помощью клонирования Gibson в соответствии с инструкциями производителя. В формате шести хорошо пластины, transfect 200,000 mESCs с одним микрограммом направляющий РНК и один микрограмм донорских шаблонов. Затем изолируйте GFP-положительные ячейки с помощью FACS.Изолировать отдельные колонии для генотипирования в соответствии с рукописными указаниями. Используйте цитометрию потока, чтобы подтвердить, что mESCs не имеют вытекающей экспрессии GFP, и, если они делают, изолировать GFP-отрицательные клетки FACS перед началом эксперимента. Расширьте клетки на пять 15-сантиметровых пластин и индуцируете экспрессию ЭЭВ дикого типа или клетки-мутанта, ввести 5-микромоляный 4-гидрокситамоксифен в течение пяти различных периодов времени от нуля часов до восьми дней.Изменение средств массовой информации после 12 часов для лечения дольше, чем это. Изолировать успешно рекомбинированную клетку FACS с помощью GFP, и выполнить ChIP-seq для H3K27me2 и H3K27me3, чтобы исследовать их временное осаждение хроматина в ответ на повторное выражение дикого типа или клетки-мутанта EED. Для проверки неопровержимых диких типа спасательных и неопровержимых мутантов спасательных систем, западные пятно было выполнено на целые экстракты после индукции дикого типа или клетки-мутант EED с 4-гидрокситамоксифен лечения.Анализ цитометрии потока был использован для подтверждения эффективности экспрессии T2A-GFP в клетках i-WT-r до и после лечения 4-гидрокситамоксифеном, что свидетельствует об успешном сальто перевернутой кассеты. ChIP-seq H3K27me3 был выполнен после повторного выражения дикого типа или клетки-мутанта EED. Появление H3K27me3 наблюдается через 12 часов после экспрессии EED дикого типа на дискретных участках нуклеации, а затем в течение 24 часов в регионах, удаленных от исходных мест нуклеации.ChIP-seq также использовался для отслеживания временного осаждения H3K27me2, которое, как представляется, предшествует осаждению H3K27me3. Очаги H3K27me3 и их рост также визуализированы с помощью микроскопии флуоресценции. После 12 часов выражения EED дикого типа, есть свидетельства образования очагов H3K27me3.Эти очаги увеличиваются в количестве и размере на 24 часа и в конечном итоге распространяются на большие области ядра на 36 часов. Точная конструкция конструкций ДНК очень важна для создания желаемой индуцируемой спасательной системы. Этот метод может обеспечить временный и особый контроль мутаций белков у мышей.Таким образом, можно определить влияние мутаций в конкретной ткани или на определенной стадии развития. В настоящее время мы используем эту систему для мониторинга динамического создания другого хроматина домена, Polycomb репрессивный комплекс 1.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

Использование ресурсов CyVerse для<em&gt; De Novo</em&gt; Сравнительная транскриптомика незанятых (немодельных) организмов

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Метод для изучения полиморфизма C924T гена рецептора тромбоксана А2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...