Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Adam J Gehring vom Toronto General Hospital Research Institute für die Bereitstellung von cDNA für HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- spezifische A2-beschränkte human-murine Hybrid-TCR-Gene, und Dr. Pei-Jer Chen von der National Taiwan University für die Bereitstellung pAAV/HBV 1.2 Konstrukt. Diese Arbeit wird vom National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 und R21AI109239 an J. S. unterstützt.

Alle Tierversuche sind vom Texas A&M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) zugelassen und werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt. Mäuse werden im Alter von 6 bis 9 Wochen verwendet.
1. Erzeugung viraler Ag-spezifischer CD8+ T-Zellen aus iPSCs (iPSC-CD8+ T-Zellen)
<ol><li>Erstellung der retroviralen Konstrukte HINWEIS: TCR- und -Gene sind mit einer 2A-S...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Generieren der viralen Ag-spezifischen iPSC-CTLs zur Verwendung als ACT zur Unterdrückung der HBV-Replikation in einem murinen Modell dar. Bei chronischer HBV-Infektion bildet das virale Genom ein stabiles Mini-Chromosom, die kovalent geschlossene kreisförmige DNA (cccDNA), die über die gesamte Lebensdauer des Hepatozyten bestehen kann. Die gezielte Clearance des viralen Mini-Chromosoms kann zu einer Heilung der chronischen HBV-Infektion führen. Die aktuelle antivirale Therapi...

Nach einer akuten Infektion kontrolliert das adaptive Immunsystem (d.h. die humorale und zelluläre Immunität) den Großteil der akuten HBV-bedingten Hepatitis. Dennoch können eine Reihe von Menschen in den HBV-endemischen Regionen die Viren nicht eliminieren und sich anschließend als chronische Individuen bekehren. Mehr als 25% der chronischen Patienten (>250 Millionen Menschen) weltweit entwickeln progressive Lebererkrankungen, die zu Leberzirrhose und/oder hepatozellulärem Karzinom (HCC)1führen. Infolgedessen bleibt die Tilgung von hartnäckig infizierten Zellen ein allgemeines Gesundheitsproblem, obwohl es einen verfügbaren Impfstoff2 gibt und zahlreiche antivirale Medikamente in der Entwicklung sind. Die Standardbehandlung bei HBV-Infektionen umfasst IFN-, Nukleosid- und Nukleotidanaloga. Diese Wirkstoffe haben direkte antivirale Aktivität und immunmodulatorische Kapazitäten. Dennoch tritt die Serokonversion von HBe-Antigen (Ag)+ Träger mit Anti-HBe-Antikörper (Ab) und Verlust von Serum HBV-Desoxyribonukleinsäure (DNA) bei etwa 20% der behandelten Patienten einzeln auf, und die gesamte immunologische Kontrolle des Virus durch den Entzug der HBsAg bestätigt wird, beträgt nicht mehr als 5%3. Darüber hinaus ist die Reaktion auf die Behandlung oft nicht haltbar. Die prophylaktische Impfung mit rekombinanten HBs Ag ist sehr wirksam bei der Vorbeugung von Infektionen, aber die therapeutische HBs Ag-Impfung ist nicht wirksam. Offensichtlich spielen T-Zell-vermittelte Immunantworten eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle von HBV-Infektionen und Leberfunktionsstörungen; Bei chronischen Hepatitis-Patienten werden HBV-reaktive T-Zellen jedoch oft gelöscht, dysfunktional oder umwandlungsbehalts4,5,6umgewandelt. Folglich haben bei Personen mit anhaltender HBV-Infektion keine Versuche zur Wiedereinführung der HBV-spezifischen Immunität (d. h. t-zellbasierte Immunität) mittels antiviraler Mittel, immunmodulatorischer Zytokine oder kurativer Immunisierung Erfolg.
Der Adoptivzelltransfer (ACT) von HBV Ag-spezifischen T-Zellen ist eine effiziente Behandlung, die darauf abzielt, die verbleibenden Hepatozyten mit HBV7,8auszurotten. ES hat sich gezeigt, dass ACT von HBV-spezifischen CTLs bei HBV-infizierten Mäusen vorübergehende, milde Hepatitis und einen dramatischen Rückgang der HBV-Ribonukleinsäure-Transkripte (RNA) in Hepatozyten verursacht. In diesen Studien hemmten CTLs nicht die Transkription von HBV-Genen, sondern verbesserten den Abbau von HBV-Transkripten9. HBV-spezifische CTLs sind wichtig, um eine Virusinfektion zu verhindern und die Clearance von HBV10,11zu vermitteln. Für ACT-basierte Heilmittel wurde vorgeschlagen, eine ideale Methode12,13,14; Dennoch sind die derzeitigen Ansätze hinsichtlich ihrer Fähigkeit, geeignete Mengen und Qualitäten von HBV-spezifischen T-Zellen von Patienten für die potenziellen Therapien zu erzeugen, zu trennen und zu züchten, eingeschränkt.
Obwohl klinische Studien Sicherheit, Praktikabilität und prospektive therapeutische Aktivität zellbasierter Behandlungen durch technisch entwickelte T-Zellen darstellen, die spezifisch für HBV-virusinfizierte Hepatozyten sind, gibt es Bedenken über die ungünstigen Auswirkungen durch Autoimmunreaktionen aufgrund von Kreuzreaktivität durch Fehlkopplung des T-Zellrezeptors (TCR)15,16, off-target Ag-Erkennung durch unspezifische TCR17 und On-Target-Off-Toxizität durch einen chimeric Ag-Rezeptor (CAR) 18 , 19 mit gesundem Gewebe. Derzeit sind die gentechnisch veränderten T-Zellen, die nur eine kurzfristige Persistenz in vivo haben, in der Regel mittlere oder spätere Effektor-T-Zellen. Bislang sind pluripotente Stammzellen (PSCs) die einzige verfügbare Quelle, um eine hohe Anzahl naiver Ag-spezifischer Ag-spezifischer T-Zellen20,21,22,23zu erzeugen. Induzierte PSCs (iPSCs) werden einfach aus den somatischen Zellen eines Patienten durch die Verwendung der Gentransduktion mehrerer Transkriptionsfaktoren umgewandelt. Infolgedessen weisen die iPSCs ähnliche Eigenschaften auf wie embryonale Stammzellen (ESCs)24. Aufgrund der Flexibilität und Möglichkeit der unendlichen Fähigkeit zur Selbsterneuerung können neben dem Gewebeersatz auch iPSC-basierte Behandlungen in der regenerativen Medizin weit verbreitet sein. Darüber hinaus können die regiments zugrunde liegenden iPSCs aktuelle zellbasierte Therapien erheblich verbessern.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine große Menge an HBV-spezifischen CTLs aus iPSCs (d. h. iPSC-CTLs) für die ACT-basierte Immuntherapie zu generieren. Die Vorteile gegenüber alternativen Techniken sind, dass HBV-spezifische iPSC-CTLs einen eintypigen TCR- und naiven Phänotyp haben, was zu mehr Speicher-T-Zellentwicklung nach der ACT führt. Es wird gezeigt, dass die ACT von HBV-spezifischen iPSC-CTLs die Migration von funktionellen CD8+ T-Zellen in der Leber erhöht und die HBV-Replikation sowohl in der Leber als auch im Blut von verabreichten Mäusen reduziert. Diese Methode zeigt eine mögliche Verwendung von viralen Ag-spezifischen iPSC-CTLs für die HBV-Immuntherapie und kann angepasst werden, um andere virale Ag-spezifische iPSC-T-Zellen für die virale Immuntherapie zu erzeugen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
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stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

Hepatitis-B-Virus (HBV) Infektion ist ein globales Gesundheitsproblem. Mit über 350 Millionen Menschen weltweit ist die HBV-Infektion nach wie vor die Hauptursache für Leberkrebs. Dies ist ein großes Anliegen, insbesondere in den Entwicklungsländern. Das Versagen des Immunsystems, eine wirksame Reaktion gegen HBV zu montieren, führt zu einer chronischen Infektion. Obwohl HBV-Impfstoff vorhanden ist und neue antivirale Medikamente entwickelt werden, bleibt die Tilgung von Virusreservoirzellen ein großes Gesundheitsthema. Hier wird eine Methode zur Generierung von viralem Antigen (Ag) -spezifische CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) beschrieben, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) (d. h. iPSC-CTLs) abgeleitet werden, die die Fähigkeit haben, die HBV-Replikation zu unterdrücken. Die HBV-Replikation wird bei Mäusen effizient durch hydrodynamische Injektion eines HBV-Expressionsplasmids pAAV/HBV1.2 in die Leber induziert. Dann werden HBV-Oberflächen-Ag-spezifische Maus-iPSC-CTLs adoptiv übertragen, was die HBV-Replikation in Leber und Blut stark unterdrückt und die HBV-Oberflächen-Ag-Expression in Hepatozyten verhindert. Diese Methode demonstriert die HBV-Replikation bei Mäusen nach hydrodynamischer Injektion und dass von Stammzellen abgeleitete virale Ag-spezifische CTLs die HBV-Replikation unterdrücken können. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Methode für die HBV-Immuntherapie.

Wie hier gezeigt, werden HBV-virale Ag-spezifische iPSC-CD8+ T-Zellen durch ein In-vitro-Kultursystem erzeugt. Nach ACT dieser viralen Ag-spezifischen iPSC-CD8+ T-Zellen unterdrücken hBV-Replikation in einem murinen Modell (Supplemental File 1). Maus iPSC werden mit dem MIDR retroviralen Konstrukt transduziert, das ein Human-Maus-Hybrid-HBV-TCR-Gen kodiert (HBs183-191-spezifisch,s183), dann werden die gentransduzierten iPSCs mit OP9-DL1/DL4-Zellen kokulturiert, die Notch...

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Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bei der Adoptivzellübertragung von iPSC-abgeleiteten viralen Antigen-spezifischen T-Zellen zur effektiven Unterdrückung der HBV-Replikation bei Mäusen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die iPSC-abgeleiteten viralen Antigen-spezifischen T-Zellen einen einzelnen Typ T-Zellrezeptor und naiven Phänotyp haben. Zur Differenzierung von HBV-spezifischen iPSC-CD8-positiven T-Zellen, Platte s183 T-Zellrezeptor-Gen-transduzierte iPSCs auf einer OP9-DL1/DL4-Monoschicht in alpha-minimum Medium, ergänzt mit 20%fetalem Rinderserum und murinem Flt3-Ligenden für ihre Kokultur in einem Zellkultur-Inkubator.Überwachen Sie die Kokultur regelmäßig, um die Zellmorphologie zu bewerten. Entfernen Sie am 28. Tag die überstandenen und schwimmenden Zellen und lösen Sie die anhaftenden Zellen mit 0,25% Trypsin. Wenn die Zellen aus dem Kulturbehälterboden gehoben haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit acht Millilitern iPSC-Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Das Pellet in 10 Milliliter frischem Medium wieder aufhängen. Verdünnen Sie die Zellen zu einer von einem iPSC abgeleiteten CD8-positiven T-Zelle auf vier s183 Peptid-gepulste Splenozyten-Verhältnisse für eine 40-stündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. In den letzten sieben Stunden vier Mikroliter verdünntes Brefeldin A in die Kultur geben, um die Transportprozesse während der Zellaktivierung zu blockieren.Stain die Zellen für die Durchfluss zytometrische Analyse der intrazellulären Zytokine von Interesse nach Standardprotokollen. Zur hydrodynamischen HBV-Plasmidabgabe durch die Schwanzvene 10 Mikrogramm HBV-Plasmid in einem 8%-Äquivalent der Körpermasse von PBS verdünnen. Laden Sie das Plasmid in eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Spur-Nadel mit 1/2 Zoll pro Maus ausgestattet ist.HHD-Mäuse unter einer Wärmelampe für fünf Minuten erhitzen, um die Schwanzvenen zu verdünnen, und ziehen Sie vorsichtig eine Maus in einen Kunststoff-Restrainer. Suchen Sie eine erweiterte seitliche Schwanzvene im mittleren Drittel des Schwanzes, und setzen Sie die Nadel parallel zur Vene ein, um das gesamte Volumen des Plasmids über einen Zeitraum von drei bis fünf Sekunden durch die Schwanzvene zu liefern. Für virale antigenspezifische iPSC-abgeleitete CD8-positive T-Zell-Adoptivzellübertragung, sammeln Sie die iPSC CD8-positiven T-Zellen am Tag 22 der Kultur, wie gezeigt, und säen Sie die Zellen auf eine neue 10-Zentimeter-Zellkulturschale.Filtern Sie die schwimmenden Zellen nach 30 Minuten im Zellkultur-Inkubator durch ein 70-Mikrometer-Nylonsieb und zählen Sie die lebensfähigen Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,5 mal 10 bis zu den sieben Zellen pro Milliliter PBS-Konzentration. Injizieren Sie 200 Mikroliter Zellen in einzelne vier bis sechs Wochen alte HHD-Mäuse, in die Schwanzvene, wie gerade gezeigt.Führen Sie am 14. Tag nach der Zellübertragung eine hydrodynamische HBV-Plasmidabgabe durch, wie gezeigt. An den entsprechenden experimentellen Endpunkten nach der Infektion ernten Sie die Leber von jedem infizierten Tier und schneiden Sie die Leber in 0,5-mal-0,5-mal-0,3-Zentimeter-Gewebeproben. Die Proben vier bis 24 Stunden in 10% neutralen Puffer formalin legen, gefolgt von einer Entkalkung in 2,5-molarer Ameisensäure für sechs bis 24 Stunden.Anschließend spülen Sie die Proben drei Minuten lang in Xylol, gefolgt von zwei zweiminütigen Spülungen in 100 %Ethanol, 95 % Ethanol und entionisiertem Wasser. Nach der letzten Wasserwäsche entkalken Sie das Gewebe in einem Millimolaren EDTA bei 90 Grad Celsius, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Wenn das Gewebe abgekühlt ist, spülen Sie die Proben vier Minuten lang in PBS ab und verwenden Sie Xylol und Ethanol, um die Proben zu deparaffinisieren und zu rehydrieren.Bei der immunfluoreszenzenten Etikettierung die Abschnitte mit 200 Mikrolitern HBV-Oberflächenantigen-spezifischem Antikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer 75 bis 100%befeuchteten Kammer färben. Am Ende der Inkubation die Proben mit fünf fünfminütigen Wärten in frischem PBS für jede Wäsche waschen. Beschriften Sie die Zellen mit DAPI nach Standardprotokollen, bevor Sie die Dias mit Abdeckungen für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie montieren.Für die immunhistochemische Analyse färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokollen und bewerten Sie die Infiltration von Entzündungszellen in die Leber durch Lichtmikroskopie. Die zytometrische Analyse der iPSC-abgeleiteten CD3-positiven CD8-positiven Population zeigt, dass die HBV-T-Zellrezeptortransduktion die Erzeugung viraler s183-spezifischer CD8-positiver T-Zellen dramatisch erhöht. Nach der Stimulation mit T-depleted Splenocytes gepulst mit s183 Peptid, CD4-negative CD8 single-positive iPSC-abgeleitete T-Zellen produzieren große Mengen an Interferon-Gamma, wie durch intrazelluläre Durchfluss zytometrische Analyse und ELISA nachgewiesen.Nach einer HBV-Infektion durch hydrodynamische Injektion erreicht die DNA-Replikation am sechsten Tag ihren Höhepunkt und reduziert sich schrittweise, wie die Echtzeit-PCR-Analyse beobachtet. Darüber hinaus ist die Virusreplikation bei Mäusen, die HBV-virale antigen-spezifische T-Zellen erhalten, zu allen Zeitpunkten signifikant reduziert, verglichen mit Mäusen, die Kontrollzellen erhalten. HBV-Oberflächenprotein ist auch bei Mäusen, die HBV-virale Antigen-spezifische pre-iPSC-Zytotoxische Lymphozyten erhalten, im Vergleich zu Mäusen, die mit Kontrollzellen behandelt wurden, erheblich reduziert, was deutlich zeigt, dass virale antigenspezifische iPSC-cd8-positive T-Zellen die Fähigkeit haben, die HBV-Replikation in einem murinen Modell zu reduzieren.Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale antigenspezifische T-Zellen aus iPSC für die Adoptivimmuntherapie erzeugt werden können.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...