Name: stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Adam J Gehring fra Toronto General Hospital Research Institute for å gi cDNA for HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-spesifikke a2-begrenset Human-murine hybrid TCR gener, og Dr. Pei-Jer Chen fra National Taiwan University for å gi pAAV/HBV 1,2 konstruere. Dette arbeidet er støttet av National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 og R21AI109239 til J. S.

Alle dyr eksperimenter er godkjent av The Texas A & M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) og er gjennomført i samsvar med retningslinjene i foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratoriedyr Care. Mus brukes i løpet av 6 – 9 ukers alder.
1. generering av viral AG-spesifikke CD8+ t celler fra IPSCs (IPSC-CD8+ t celler)
<ol><li>Opprettelse av retroviral konstruksjoner Merk: TCR α-og β-gener er koblet sammen med 2A selv spalte sekvens. De...

<ol>
	<li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice.">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li><li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+(HBV)+vaccine-induced+immunity.">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li><li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li><li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8++T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction.">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li><li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B.">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li><li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells.">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).</li><li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines.">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form,+cccDNA,+Without+Cytolysis.">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li><li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection.">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li><li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens.">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li><li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees.">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8++T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity.">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li><li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li><li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells.">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li><li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity.">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li><li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells.">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li><li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+(iCARs)+divert+off-target+immunotherapy+responses.">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans.">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li><li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity.">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8(+)+T+cells.">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li><li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance.">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells.">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li><li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes.">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).</li><li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8++T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells.">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells.">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li><li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy.">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6C(+)+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice.">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes.">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li><li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice.">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li><li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice.">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li></ol>

Denne protokollen presenterer en metode for å generere viral AG-spesifikke iPSC-CTLer for bruk som ACT for å undertrykke HBV-replikering i en murine-modell. I kronisk HBV-infeksjon danner viral-Genova et stabilt mini-kromosom, covalently lukkede, sirkulære DNA (cccDNA) som kan vedvare gjennom hele levetiden til hepatocytter. Rettet mot clearance av viral mini kromosom kan resultere i en kur av kronisk HBV infeksjon. Nåværende antiviral behandling mål viruset reversere transkriptase men sjelden etablerer immunologis...

Etter akutt infeksjon kontrollerer det adaptive immunsystemet (dvs. humoral og cellulær immunitet) hoveddelen av akutt HBV-relatert hepatitt. Likevel kan en rekke mennesker i HBV-endemiske regioner ikke eliminere virusene og deretter konvertere som kroniske individer. Mer enn 25% av kroniske pasienter (> 250 millioner mennesker) verden over utvikler progressiv leversykdom, noe som resulterer i skrumplever og/eller leverkreft (HCC)1. Som et resultat, er utryddelsen av bevisst infiserte celler fortsatt et generelt healthiness problem, selv om det er en tilgjengelig vaksine2 og mange antivirale legemidler er under utvikling. Standard behandling for HBV-infeksjon inkluderer IFN-α, nukleosid og nukleotid analoger. Disse agentene har direkte antiviral aktivitet og immun modulatory kapasiteter. Likevel, serokonversjon av HBe antigen (AG)+ bærere med anti-HBe antistoff (AB) og tap av serum HBV deoksyribonukleinsyre acid (DNA) vises individuelt i ca 20% av behandlede pasienter, og hele immunologiske kontroll av viruset verifisert av deprivasjon av HBsAg er ikke mer enn 5%3. Videre er responsen på behandlingen ofte ikke holdbar. Forebyggende vaksinasjon med rekombinant HBs AG er svært effektiv i å forebygge smitte, men terapeutisk HBs AG vaksinasjon er ikke effektiv. Åpenbart T celle-mediert immunresponser spille en avgjørende rolle i å kontrollere HBV infeksjon og nedsatt leverfunksjon; men i kroniske hepatitt pasienter, HBV-reaktive T celler er ofte slettet, dysfunksjonelle, eller konvertere oppbrukt4,5,6. Følgelig, hos personer med vedvarende HBV-infeksjon, ingen forsøk på å gjeninnsette HBV-spesifikk immunitet (dvs. T celle-basert immunitet) ved hjelp av anti-viral middel, Immuno-modulatory cytokiner, eller helbredende immunisering har oppnådd suksess.
Adopsjon celle overføring (Act) av HBV AG-spesifikke T-celler er en effektiv behandling rettet til slutt utrydde resterende hepatocytter wih HBV7,8. ACT av HBV-spesifikk CTLer i HBV-infiserte mus har vist seg å forårsake forbigående, mild hepatitt, og et dramatisk fall i ribonukleinsyre av HBV-syre (RNA) i hepatocytter. I disse studiene hemmer CTLer ikke transkripsjon av HBV gener, men forbedret nedbrytning av HBV transkripsjoner9. HBV-spesifikke CTLer er viktige for å forebygge virus infeksjon og megle i clearance av HBV10,11. For Act-baserte løsninger har in vitro-utvidelse av HBV-spesifikke T-celler med høy reaktivitet for in vivo-omplassering blitt foreslått å være en ideell metode12,13,14; Likevel er nåtidens tilnærminger begrenset med hensyn til deres evne til å generere, skille og dyrke passende mengder og kvaliteter av HBV-spesifikke T-celler fra pasienter for potensielle terapier.
Selv om kliniske studier presenterer sikkerhet, gjennomførbarhet, og potensiell terapeutisk aktivitet av celle-baserte behandlinger ved hjelp av konstruert T-celler som er spesifikke for HBV virus-infiserte hepatocytter, det er bekymringer om ugunstige virkninger oppstår fra autoimmune responser på grunn av kryss-reaktivitet fra mispairing T celle reseptor (TCR)15,16, off-Target AG anerkjennelse av ikke-spesifikk TCR17 og på-målet off-toksisitet av en chimeric AG reseptor (bil) 18 av år , 19 med sunt vev. Foreløpig er genmodifiserte T-celler, som bare har kortsiktig utholdenhet i Vivo, vanligvis middels eller senere effektor T-celler. Hittil Pluripotent stamceller (PSCer) er den eneste kilden tilgjengelig for å generere høye antall naive enkelt-type AG-spesifikke T celler20,21,22,23. Indusert PSCer (iPSCs) er ganske enkelt konverteres fra pasientens somatiske celler gjennom bruk av genet Transduction av flere transkripsjon faktorer. Som et resultat, iPSCs har lignende egenskaper som de av embryonale stamceller (ESCs)24. På grunn av fleksibiliteten og muligheten for uendelig evne til å fornye seg selv, i tillegg til vev erstatning, iPSC-baserte behandlinger kan bli mye brukt i regenererende medisin. Videre kan regimenter underliggende iPSCs betydelig forbedre dagens celle-baserte terapier.
Det overordnede målet med denne metoden er å generere en stor mengde HBV-spesifikke CTLer fra iPSCs (dvs. iPSC-CTLer) for ACT-based immunterapi. Fordelene fremfor alternative teknikker er at HBV-spesifikke iPSC-CTLer har en enkelt type TCR og naiv fenotype, noe som resulterer i mer minne T celle utvikling etter ACT. Det er demonstrert at ACT av HBV-spesifikke iPSC-CTLer øker migrasjon av funksjonelle CD8+ T celler i leveren og reduserer HBV replikering i både lever og blod administrert mus. Denne metoden avslører en potensiell bruk av viral AG-spesifikke iPSC-CTLer for HBV-immunterapi og kan tilpasses til å generere andre viral AG-spesifikke iPSC-T-celler for viral immunterapi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HHD mice</td>
			<td>Institut Pasteur, Paris, France</td>
			<td></td>
			<td>H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td>RIKEN Cell Bank</td>
			<td>APS0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNL76/7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV/HBV1.2 plasmid</td>
			<td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td>HBV DNA construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td>
			<td></td>
			<td>FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (V&#945;34 and V&#946;28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264-specific TCR genes</td>
			<td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td>
			<td></td>
			<td>SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (17A2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44 (IM7) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8 (53-6.7) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#947; (XMG1.2) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10490-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MA5-13059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ABCD1234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJammer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>204130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td>
			<td>Proimmune</td>
			<td>F027-4A - 27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Anti-Mouse Secondary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFlt-3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease S7</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-derived viral ag-specific t lymphocytes suppress hbv replication in mice

Hepatitt B-viruset (HBV) er et globalt helseproblem. Med over 350 000 000 mennesker rammet over hele verden, HBV infeksjon fortsatt den ledende årsak til leverkreft. Dette er en stor bekymring, spesielt i utviklingsland. Svikt i immunsystemet å montere en effektiv reaksjon mot HBV fører til kronisk infeksjon. Selv om HBV-vaksine er til stede og romanen antivirale legemidler blir opprettet, er fjerning av virus reservoar celler fortsatt et viktig helse tema. Beskrevet her er en metode for generering av viral antigen (AG)-spesifikke CD8+ cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) avledet fra indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) (dvs. IPSC-CTLer), som har evnen til å undertrykke HBV replikering. HBV-replikering er effektivt indusert i mus gjennom hydrodynamisk injeksjon av et HBV-uttrykk plasmider, pAAV/HBV 1.2, i leveren. Deretter, HBV overflate AG-spesifikk mus iPSC-CTLer er adoptively overføres, som i stor grad undertrykker HBV-replikering i lever og blod, samt hindrer HBV overflate AG uttrykk i hepatocytter. Denne metoden demonstrerer HBV-replikering i mus etter hydrodynamisk injeksjon og at Stamcelle-avledet viral AG-spesifikke CTLer kan undertrykke HBV-replikering. Denne protokollen gir en nyttig metode for HBV-immunterapi.

Som vist her, er HBV viral AG-spesifikke iPSC-CD8+ T celler generert av et in vitro kultur system. Etter ACT av disse viral AG-spesifikke iPSC-CD8+ T celler vesentlig undertrykke HBV-replikering i en murine-modell (tilleggsfil 1). Mouse iPSC er transduced med MIDR retroviral konstruere koding en menneskelig mus hybrid HBV TCR genet (HBs183-191-spesifikk, s183), så genet-transduced iPSCs er co-KULTIVERT med OP9-DL1/DL4 celler uttrykker hakk ligander (både DL1 og DL4) mol...

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice at JoVE.com

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Presentert her er en protokoll for effektiv undertrykkelse av hepatitt B-viruset (HBV) replikering i mus ved å utnytte adoptiv celle overføring (ACT) av stilk cellen-avledet viral antigen (AG)-spesifikke T-lymfocytter. Denne prosedyren kan tilpasses for potensielle ACT-baserte immunterapi av HBV-smitte.

Stem Cell-avledet viral AG-spesifikke T-lymfocytter Undertrykk HBV-replikering i mus

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i adoptivcelleoverføring av iPSC-avledet viral antigenspesifikk T-celle for effektiv undertrykkelse av HBV-replikering hos mus. Den største fordelen med denne teknikken er at iPSC-avledede virale antigenspesifikke T-celler har en enkelt type T-cellereseptor og naiv fenotype. For differensiering av HBV-spesifikke iPSC CD8-positive T-celler, plate s183 T celle reseptor gentransdusert iPSCs på en OP9-DL1/DL4 monolayer i alfa-minimum medium supplert med 20% fosterbovin serum og murine Flt3 ligand for sin co-kultur i en cellekultur inkubator.Overvåk samkulturen regelmessig for å vurdere cellemorfologien. På dag 28 fjerner du de overnaturlige og flytende cellene, og løsner de tiltalende cellene med 0,25% trypsin. Når cellene har løftet fra kulturbeholderbunnen, stopp den enzymatiske reaksjonen med åtte milliliter i iPSC-medium, og samle cellene ved sentrifugering.Resuspend pellet i 10 milliliter friskt medium. Fortynn cellene til en iPSC-avledet CD8-positiv T-celle til fire s183 peptid-pulserende miltyteforhold for en 40-timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren. I løpet av de siste syv timene, legg til fire mikroliter fortynnet brefeldin A til kulturen, for å blokkere transportprosessene under celleaktivering.Beis cellene for strømningscytokometrisk analyse av de intracellulære cytokinene av interesse i henhold til standardprotokoller. For hydrodynamisk HBV plasmidlevering gjennom halevenen, fortynne 10 mikrogram HBV plasmid i en 8% tilsvarende kroppsmassen av PBS. Legg plasmiden i en tre-milliliter sprøyte utstyrt med en 26-gauge, 1/2-tommers nål per mus.Varm HHD-mus under en varmelampe i fem minutter for å utvide haleårene, og trekk forsiktig en mus inn i et plastrespesende. Finn en utvidet lateral halevene i den midterste tredjedelen av halen, og sett nålen parallelt med venen for å levere hele volumet av plasmid gjennom halevenen over en tre til fem-sekunders periode. For viral antigen-spesifikk iPSC-avledet CD8-positiv T-celle adoptiv celleoverføring, samle iPSC CD8-positive T-celler på dag 22 av kultur som demonstrert, og frø cellene på en ny 10-centimeter celle kultur parabolen.Etter 30 minutter i cellekulturinkubatoren filtrerer du de flytende cellene gjennom en 70-mikrometer nylonsil, og teller de levedyktige cellene. Fortynn cellene til en 1,5 ganger 10 til de syv cellene per milliliter PBS konsentrasjon. Injiser 200 mikroliter celler i individuelle fire til seks uker gamle HHD-mus, inn i halevenen som nettopp demonstrert.På dag 14 etter celleoverføring, utfør en hydrodynamisk HBV plasmid levering som demonstrert. Ved passende eksperimentelle endepunkter etter infeksjon, høst leveren fra hvert infiserte dyr, og kutt leverene i 0,5-by-0,5-by-0,3-centimeter vevsprøver. Plasser prøvene i 10% nøytral buffer formalin i fire til 24 timer, etterfulgt av avkalking i 2,5-molar maursyre i seks til 24 timer.Skyll deretter prøvene i xylen i tre minutter, etterfulgt av to to minutters skylling i 100% etanol, 95% etanol og deionisert vann. Etter den siste vannvasken avkalker vevet i en millimolar EDTA ved 90 grader Celsius, etterfulgt av en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur. Når vevet er avkjølt, skyll prøvene i PBS i fire minutter, og bruk xylen og etanol til å deparaffinisere og rehydrere prøvene.For immunofluorescerende merking, beise seksjonene med 200 mikroliter HBV overflate antigen-spesifikt antistoff i to timer ved romtemperatur i en 75 til 100% fuktet kammer. På slutten av inkubasjonen vask prøvene med fem fem minutters vasker i frisk PBS for hver vask. Merk cellene med DAPI i henhold til standardprotokoller før du monterer lysbildene med dekkslepper for avbildning ved fluorescensmikroskopi.For immunohistokjemisk analyse, flekk seksjonene med hematoksylin og eosin i henhold til standardprotokoller, og vurder infiltrasjon av inflammatoriske celler i leveren ved lett mikroskopi. Flow cytometrisk analyse av iPSC-avledet CD3-positiv CD8-positiv befolkning avslører at HBV T celle reseptortransduksjon dramatisk øker genereringen av viral s183-spesifikke CD8-positive T-celler. Etter stimulering med T-utarmet miltytter pulsert med s183 peptid, CD4-negativ CD8 enkeltpositive iPSC-avledede T-celler produserer store mengder interferon gamma, som påvist ved intracellulær strømning cytometrisk analyse og ELISA.Etter HBV-infeksjon ved hydrodynamisk injeksjon topper DNA-replikeringen på dag seks og reduseres gradvis, som observert ved sanntids PCR-analyse. Videre reduseres viral replikering betydelig til enhver tid hos mus som mottar HBV virale antigene-spesifikke T-celler sammenlignet med mus som mottar kontrollceller. HBV overflateprotein er også betydelig redusert hos mus som mottar HBV viral antigenspesifikke pre-iPSC cytotoksiske lymfocytter sammenlignet med mus behandlet med kontrollceller, tydelig viser at viral antigenspesifikke iPSC CD8-positive T-celler har evnen til å redusere HBV-replikering i en murine modell.Du bør nå ha en god forståelse av hvordan du genererer virale antigenspesifikke T-celler fra iPSC for adoptivimmunterapi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Isolasjon og Th17 Differensiering av naive CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk feste analysen for Study of inte Activation i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolering av Viral Replication Kammer-beriket Sub-atom Fraksjoner fra Adenovirus-infiserte Normal humane celler

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolasjon Protokoll for B og T-lymfocytter fra Menneskerettighets Palatine Mandlene

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering av IL-22-uttrykke lymfocytter Bruke Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...