Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتكنولوجيا من خلال التمويل الأساسي وجائزة البحوث التنافسية (CRG3) إلى S.M. H.

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

في هذه الدراسة، تم تنفيذ تقنيات smFRET مختلفة لتحديد حركية قرار HJ من قبل GEN130. وقد استخدمت نهج smFRET مماثلة لمتابعة متطلبات مطابقة الحمض النووي رفرف مزدوج والانقسام من قبل النسخ المتماثل الحمض النووي وإصلاح رفرف endonuclease 142،43،44. هنا، تتم مناقشة الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. يجب أن يكون رد فعل السيلان خالية من أي أثر للرطوبة. يجب تطبيق حل البيغيليشن بسرعة على الزجاج السيلاني بمجرد حل PEG لتجنب التحلل المائي. في خلية التدفق متعددة القنوات، يجب إزالة أي هواء محاصر في ورقة لاصقة لتجنب التسرب بين القنوات المجاورة. وينبغي أن يكون الحل PCA أعدت حديثا لأنه يتأكسد مع مرور الوقت. إضافة 10 N NaOH ينبغي أن يكون قطرة، مع دوامة في ما بين. يجب أن تكون خلفية الفلورة في غطاء الحد الأدنى قبل أن تتدفق HJ المسمى الفلورسنت. يجب إجراء التصوير في خلية التدفق في اتجاه واحد لتجنب تصوير المناطق المبيضة. في تجارب ALEX، يجب تقليل قوة الليزر الأحمر لتجنب التبييض السريع للمقبول. في تجارب الفاصل الزمني، يجب أن يكون وقت الدورة أقصر من أسرع حدث.
smFRET هو تقنية حساسة التي يمكن أن توفر رؤى قيمة في الوقت الحقيقي في التفاعلات الجزيئية الحيوية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لديها العديد من التحديات التقنية، من بينها تحقيق تغيير قابل للقياس في فريت أثناء التفاعل البيوكيميائي. هذا ضروري للحصول على ميزات منفصلة بشكل جيد في الرسوم البيانية والدول المميزة في آثار الزمن. في كثير من الحالات، يتطلب smFRET تصميم دقيق للركائز، واختيار أزواج الفلوروفور ومواقفهم، وتضخيم التغييرات في حالة نقص في الحمض النووي في الركيزة بسبب التغييرات الهيكلية قليلا في الركيزة45. نهج آخر لأداء FRET هو استخدام البروتينات المسماة46. ويقتصر نافذة المراقبة في فريت من قبل استقرار مقبول مثل Cy5 أو اليكسا فلور 647 الذي يميل إلى التبييض بسرعة أكبر من المانح (Cy3 في هذه الحالة). لذلك، يتطلب الاتحاد البحث المستمر عن الفلوروفوريس مستقرة لتمديد مدة التجربة والجهود المبذولة لتطوير أنظمة مسح الأكسجين لإطالة إشارة الفلورة وتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء47،48 .
من بين النصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في smFRET هو موازنة العديد من المعلمات المشاركة في التصوير مثل قوة الليزر، ووقت التعرض، ووقت الدورة، وعدد من الدورات لتحقيق أقصى قدر من الانبعاثات الفلورية، وإطالة مدة التجربة، وتحقيق الفواصل الزمنية المناسبة لأخذ العينات لديناميات الإنزيم. تعد أوقات المراقبة والآثار الأدنى من تبييض الصور ضرورية للحصول على توزيعات وقت الجلوس عالية الدقة التي تمثل ديناميات الإنزيم. ALEX يولد أفضل الرسوم البيانية منذ هذا الأسلوب يخضع لمساهمات أقل من الجسيمات الضوئية بالمقارنة مع FRET لون واحد. ومع ذلك، الدقة الزمنية في ALEX أقل من ذلك في FRET لون واحد.
وأخيراً، فإن تركيز smFRET على الكشف عن التغيرات المطابقة/الهيكلية في الجزيئات الفردية في الجسور في الوقت الحقيقي الفجوة بين التقنيات الهيكلية عالية الدقة (أي التصوير البلوري بالأشعة السينية، والرنين المغناطيسي النووي، والمجهر الإلكتروني)، الذي يوفر التفاصيل الهيكلية الدقة الذرية في ظل ظروف ثابتة والأساليب السائبة التي تسفر عن متوسط الفرقة من خاصية قابلة للقياس. في العديد من الجوانب، وقد ثبت smFRET أن تكون تقنية قوية لدراسة النظم البيولوجية في الوقت الحقيقي.

توفر أساليب جزيء واحد على أساس الكشف عن الفلورة نسب إشارة إلى ضوضاء عالية1. FRET هو تقنية مطيافية يمكن قياس المسافات في نطاق 1-10 نانومتر، مما يجعل هذه التقنية كمسطرة جزيئية لقياس المسافات في نطاق نانومتر2،3. وطيف امتصاص المقبل له تداخل طيفي جزئي مع طيف انبعاثات المانح في نهاية الطول الموجي أقصر. يتم التوسط في فريت من خلال نقل الطاقة أقل من الإشعاع بين المانح وزوج مقبول، في حين أن كفاءة نقل الطاقة تعتمد على المسافة والتوجه من مقبول4.
وقد تم تنفيذ العديد من النهج لتقليل الخلفية وتحسين كفاءة الكشف عن إشارة الفلورة5و6. نهج واحد هو الفحص المجهري البؤري، حيث ثقب يقيد بقعة الإثارة إلى حجم أقل من الحد الانعراج7. وثمة نهج آخر هو الفلورة التأمل الداخلي الكلي (TIRF)، وهو تقنية إضاءة واسعة المجال حيث يتم توجيه الضوء خارج المحور فوق زاوية حرجة8. ثم ينعكس الضوء داخليا تماما في واجهة بين الزجاج والحل المائي، وتوليد موجة المبشرة التي تضيء فقط الفلوروفورتعلق على سطح الزجاج ويمنع الخلفية من الفلوروفور في بقية الحل.
في الفحص المجهري البؤري، يمكن أن تكون الجزيئات إما نشر بحرية أو تعطيل السطح. يمكن أن يكون القرار الزمني الذي تم تحقيقه ضمن ميكروثانية إلى عدة مللي ثانية9. يتم إجراء الكشف البؤري لجزيء واحد بواسطة صمام ثنائي الانهيارات الثلجية أحادي الفوتون (SPAD) والمسح الضوئي نقطة بنقطة من المنطقة ذات الاهتمام10. في TIRF، يتم تسجيل سلسلة زمنية من بضع مئات من الجزيئات المعطلة على السطح بواسطة جهاز كشف ثنائي الأبعاد حساس للموقف مقترن بـ (CCD). وتزيد اتفاقية مكافحة التصحر من إشارة الفلورة إما عن طريق تكثيف شاشة الفوسفور ولوحة القناة الدقيقة أو عن طريق الضرب على رقاقة الإلكترونات الضوئية (EMCCD). القرار الزمني يعتمد على سرعة القراءة وكفاءة الكم من اتفاقية مكافحة التصحر وعادة على ترتيب بضع عشرات من مللي ثانية6.
HJ هو وسيط مركزي في إصلاح الحمض النووي وإعادة تركيب11،12،13،14. HJ اثنين من خيوط عبور مستمرة واثنين من التي تربط بين خيوط مستمرة دون تقاطع بعضها البعض. HJ موجود في الحل كما X-مكدسة المعاقات، والتي تخضع للايزومرات المستمر من قبل خيوط مستمرة تصبح عبور وخيوط عبور تصبح مستمرة في15conformer أخرى. تفضيل أيزومر من HJ يعتمد على التسلسل الأساسي والبيئة الأيونية وقد درست على نطاق واسع من قبل اريت16،17،18،19.
GEN120 هو بروتين أحادي في الحل21 ويتطلب التميّز لشق HJ، مما يسمح بالفصل السليم للخيوط المعاد دمجها22،23. تفضيل التجصيّق للـ HJ يؤثر على نتيجة إعادة التركيب الوراثي من خلال تحديد اتجاه القرار من قبل HJ resolveases24. فهم كيفية ربط GEN1 HJ، وتنسيق الشقين، ويضمن حلها الكامل كانت جميعها تحت دراسة مكثفة21،22،23،25،26 ،27،28،29،30.
في هذه الدراسة، يتم استخدام إنشاء TIRF على أساس موضوعي كما هو موضح سابقا31. يتم تطبيق الإثارة بالتناوب بلونين (ALEX) لتحديد التغيرات المطابقة عند تفاعل GEN1 مع الفلوروفور المسمى HJ. ALEX تنتج 2D الرسوم البيانية على أساس اثنين من المعلمات قياس النسب ة كفاءة E، وهو المانح ة يقبل تعتمد على بعد، والمعلمة stoichiometry S، الذي يقيس stoichiometry المانحة والمقبولة32. اليكس تمكن من فرز الأنواع الفلورية على أساس stoichiometries من الفلوروفورس بما في ذلك المانحين فقط، ومقبول فقط، ومجموعة فرعية مختلطة. ALEX يمكن توسيع نطاق استخدام FRET إلى مجموعة كاملة ويمكن الكشف عن الاختلافات في سطوع الفلوروفور وoligomerization وكذلك رصد التفاعلات جزيء ligand33.
وقد وجد أن GEN1 ينجح باستمرار في حل HJ خلال عمر مجمع GEN1-HJ. وتستمد التغيرات المطابقة المعتمدة على الوقت من آثار الزمن للجزيئات الفردية، في حين أن الرسوم البيانية تمثل توزيع السكان الأساسيين. باستخدام الفاصل الزمني لون واحد FRET، يتم عرض سريع على معدلات وبطء معدلات قبالة لDIMER GEN1، مما يزيد من تقارب ديمر GEN1 تجميعها في المنتج شق الأول.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

تقيس الطرق السائبة سلوك المجموعة من الجزيئات، حيث يتم متوسط معدلات التفاعل الفردية للخطوات الأساسية في جميع أنحاء السكان. يوفر نقل الطاقة بالرنين (smFRET) أحادي الجزيء تسجيلًا للتغيرات المطابقة التي تحدثها الجزيئات الفردية في الوقت الحقيقي. ولذلك، smFRET قوية في قياس التغيرات الهيكلية في الإنزيم أو الركيزة أثناء الربط والحفز. يقدم هذا العمل بروتوكولًا لتصوير جزيء واحد للتفاعل بين تقاطع هوليداي رباعي الاتجاه (HJ) وفجوة إندونوكليس الأول (GEN1)، وهو إنزيم إعادة تركيب متجانس دوري. كما تقدم هي لون واحد واثنين من لون بالتناوب الإثارة (أليكس) smFRET البروتوكولات التجريبية لمتابعة قرار HJ من قبل GEN1 في الوقت الحقيقي. يتم تحديد حركية التمهّل GEN1 في HJ، الذي اقترح أن يلعب دوراً رئيسياً في حل HJ وظلت بعيدة المنال حتى الآن. التقنيات الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع للحصول على رؤى ميكانيكية قيمة للعديد من أنظمة الحمض النووي الإنزيم.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

يعرض هنا بروتوكول لتنفيذ جزيء واحد Förster نقل الطاقة الرنين لدراسة قرار HJ. يتم استخدام الإثارة بالتناوب بلونين لتحديد ثوابت التفكك. ثم يتم تطبيق smFRET الفاصل الزمني لون واحد في الاختبارات الانقسام في الوقت الحقيقي للحصول على توزيع الوقت يسكن قبل قرار HJ.

واحد جزيء Förster الرنين أساليب نقل الطاقة للتحقيق في الوقت الحقيقي من قرار تقاطع هوليداي من قبل GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

هذا البروتوكول يتيح لنا رصد ديناميات التفاعل ودقة تقاطع هوليداي من قبل رفرف endonuclease 1 على مستوى جزيء واحد وغيرها من النظم الأنزيمية. حسنا، بعض سوف متوسط في جميع أنحاء السكان الجزيئية أو يؤمن الخطوات الآلية الفردية الكامنة وهناك. توفر طرق الجزيء المفرد هذه التفاصيل من خلال مراقبة سلوك الجزيئات الفردية في الوقت الحقيقي.يمكن لطرق الجزيء الواحد أن تكتشف التفاعلات الجزيئية الحيوية بكفاءة في نطاق البيكو و nanomolar مع خصوصية عالية. وهو مفيد للعديد من الحلول العملية في التشخيص ، وتسلسل الجينوم ، والاستشعار. البصرية والقسرية أساليب قياس جزيء واحد تطبق على نطاق واسع في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا وثبت أن تقديم ملاحظات النبيلة التي لا يمكن الوصول إليها من خلال أساليب أخرى.نصيحتي للمستخدمين لأول مرة هو أن تتبع عن كثب الخطوات التفصيلية المنصوص عليها في هذا البروتوكول. وسوف تؤدي الرسوم التوضيحية المرئية للإجراء العملي لهذا البروتوكول إلى التنفيذ الناجح لهذه التقنية. لإعداد خلية تدفق قناة واحدة، تبدأ بحفر اثنين من ثقوب قطرها 1.22 ملليمتر في الجزء الأوسط من 50 في 20 ملليمتر انزلاق الكوارتز مع المراكز 37 ملليمتر عن بعضها البعض و 6.5 ملليمتر من حافة الشريحة.استخدام قاطع الإلكترونية لقطع قناة 41 في 2.25 ملليمتر إلى قطعة 50 في 20 ملليمتر من ورقة لاصقة مزدوجة وتقشر قبالة الجانب البلاستيك من الغطاء الواقي. محاذاة حواف قطعة مع حواف الشريحة الكوارتز واستخدام زوج من ملاقط البوليتيترافلورو ايثيلين لإزالة بلطف أي فقاعات الهواء المحاصرين. قشر قبالة الجانب ورقة من قطعة لاصقة وجبل قطعة على سطح وظيفية من زلة الغطاء.بعد ذلك، قطع قطعة واحدة من أنابيب البولي إيثيلين مع قطر داخلي من 1.22 ملليمتر إلى 11 سنتيمترا طولا للمدخل وقطعة واحدة من أنابيب إلى 25 سنتيمترا للمأخذ. ثم أدخل الأنابيب في الثقوب التي تم حفرها سابقًا كداخلة ومنافذ لخلية التدفق. واستخدام الغراء الايبوكسي خمس دقائق لختم حواف واجهة غطاء الكوارتز في مدخل ومنافذ الأنابيب.عندما جفت الخلية، واستخدام حقنة 1 ملليمتر لطرد 0.2 ميكرومتر تصفية 0.03 ملليغرام لكل ملليلتر تركيز avidin في PBS في الخلية باستخدام حقنة ثانية مليئة المخزن وحده لغسل أي أفدين الزائدة في نهاية غزير. لتنفيذ تجربة FRET أحادية اللون، أولاً تطبيق قطرة واحدة من زيت الغمر على 100 مرة مجموع التركيز الداخلي الفلوري الهدف وتعيين على الضرب رقاقة من photoelectrons إلى مكسب مناسب لتحسين الإشارة إلى الخلفية ومنع التشبع. ضع خلية التدفق بعناية على حامل العينة، واستخدم تعديل الدورة التدريبية لرفع الهدف تدريجيًا حتى يلمس الزيت زلة الغطاء.بدوره على الليزر 532 نانومتر والتبديل إلى وضع التكيف الدقيق للهدف. توجيه الانبعاثات إلى منفذ الكاميرا لمراقبة الصورة على الشاشة وضبط ارتفاع الهدف حتى يتم إحضار السطح الوظيفي لزلة الغطاء في التركيز ويمكن ملاحظتها على الشاشة. تحقق من أن الخلفية من السطح الوظيفي للزلات الغطاء لا يتجاوز عدد قليل من البقع قبل تتدفق في HJ المسمى fluorescently. عندما يكون النظام جاهزاً عند 0.2 إلى 0.5 ميكرولترات من الركيزة المخففة من الفائدة إلى 120 ميكرولترات من العازلة التصوير مع نظام الكسح الأكسجين في أنبوب 0.5 ملليلتر وربط منفذ الخلية البطيئة إلى مضخة حقنة.أدخل أنبوب المدخل في أنبوب 1.5 ملليلتر وابدأ في مضخة الحقنة في 30 إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة لسحب المحلل من الأنبوب. صورة في كثير من الأحيان السطح لفترة وجيزة مع الليزر الأخضر لتأكيد تغطية جيدة من الخلية مع 100 إلى 300 جزيئات من الركيزة موزعة بشكل متجانس، متباعدة جيدا. إذا كان سطح الخلية تدفق مغطاة بشكل كاف، طرد آخر 120 ميكرولترات من العازلة التصوير في 30 إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لغسل أي HJ غير منضم والسماح لخلية تدفق للجلوس لمدة 5 دقائق للسماح لنظام الاستنساب الأكسجين لاستنفاد الأوكسجين المذاب.تعيين وقت التعرض إلى ما يقرب من 60 ميلي ثانية. سيتم تعيين وقت الدورة تلقائيا من قبل البرنامج على أساس سرعة نقل البيانات. حدد العدد المطلوب من الدورات أو الإطارات إلى 400 تقريبًا.يتم تقسيم الانبعاثات من المتبرع وفلوروفهورات المتقبل إلى قنوات ملونة بواسطة جهاز تقسيم الصور. حدد منطقة مناسبة على السطح، وضبط ارتفاع الهدف للتركيز على الصورة وتسجيل وحفظ الفيلم في شكل tiff 16 بت. ثم الانتقال إلى منطقة جديدة.قم بشطف الخلية بـ 120 ميكرولترات من عازلة التصوير المُكملة بتركيزات GEN1 المشار إليها بمعدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة، وتركيز واحد في كل مرة. في قرار التجربة انشقاق HJ، وضبط معدل التدفق إلى 110 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة وبدء تسجيل 5 إلى 10 ثوان قبل دخول الانزيم في خلية التدفق. التصوير لبدء 5 إلى 10 ثانية قبل دخول الانزيم في خلية تدفق سوف تعظيم عدد الأحداث.عندما يتم اختبار جميع التركيزات، استخدم شريحة حبة فلورية ثابتة لرسم خريطة للذروة وجزيئات المتقبلة لبعضها البعض في جهاز تقسيم الصور. بعد تثبيت حزمة البرامج المناسبة لتوليد مصفوفة التحول، فتح الفيلم الشريحة حبة المسجلة وتحديد مواقف من الخرز الفردية في القنوات المانحة والمقبلة. عندما تم إنشاء المصفوفة من الشريحة حبة ثابتة انقر فوق تحميل TFORM وحدد ملف مصفوفة التحويل.في القائمة المنسدلة من تصفية القناة، انقر فوق خيار D & A لتحديد الجسيمات التي تحمل اسم المتبرع والمقبِل. ثم، أدخل plotTimetraceCW كما هو مع تعليمات في الدليل لتوليد آثار الوقت لكل جزيء. لتنفيذ تجربة ALEX FRET ، سجل فيلم يتكون من إطارات متتالية من الانبعاثات المانحة والمقبِلة عن طريق الإثارة المباشرة مع الليزر الأخضر والأحمر.فتح الأفلام التي تم الحصول عليها ALEX وتعيين عتبة الكشف المناسبة في حوالي 300 لكل من الانبعاثات المانحة بسبب الإثارة المانحة، والانبعاثات المقبولة بسبب الإثارة المانحة، والانبعاثات المقبولة بسبب قنوات الإثارة المباشرة. تطبيق مرشحات قناة مناسبة لتحديد للجسيمات التي كانت على حد سواء المانحة والمقبِل وربط 200 إلى 300 الجسيمات في كل من القنوات الثلاث. استخدام plotHistALEX MATLAB رمز لتوليد الرسوم البيانية اليكس تركيب قمم مختلفة في وظائف الرسم البياني واستخدام الرسم البياني مناسبة وتحليل البرنامج لتحديد النسبة المئوية للمنطقة تحت المنحنى لكل مجموعة سكانية.ثم استخدم رمز MATLAB Time time for كل جزيء الذي يظهر انبعاث المتبرع بالإثارة المباشرة في الانبعاثات المقبولة بسبب FRET والإثارة المباشرة. هذا الممثل بالتناوب الإثارة FRET المدرج التكراري للتسمية المجاورة X-0 يظهر اثنين من القمم التي تتوافق مع interchanging من ايزومرات أكثر وفرة وأقل وفرة. وتتوافق معدلات الإيزومير التي تم الحصول عليها من مدرجات الزمن في سكن من الأيزومرات مع تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقاً.جزيء واحد FRET المدرجات البيانية من تقاطع التسمية X-0 المجاورة في تركيزات GEN1 مختلفة التي اكتسبتها ALEX، تكشف عن ذروة واحدة المقابلة لايزومر فريت عالية حرة وذرية واحدة المقابلة للسكان HJ ملزمة بعد طرح مساهمة الايزومر أقل وفرة من ذروة فريت منخفضة. في تركيز GEN1 المشبعة، يحتوي الرسم البياني FRET X-0 على ذروة واحدة منخفضة من FRET تقابل GEN1 مرتبطة بأي من الأيزومر من HJ كما هو متوقع من قبل النموذج. إن ربط جين 1 مونومير بـ HJ متبوعاً بتشكيل أكثر لطفاً هو ميزة فريدة من سمات حل HJ أحادي النواة GEN1 مقارنة بالحلول البروكارية التي توجد في شكل ثنائي وميريكي في الحل.مزيد من الأدلة على أن GEN1 مونومر يربط ويشوه HJ هو ملاحظة عدد كبير من آثار الجسيمات غير المكدّسة مع حالة فريت منخفضة مستقرة في وجود المغنيسيوم في تركيزات منخفضة GEN1. رحيل المانح والمقبِل في وقت واحد بعد حالة من حالة FRET المنخفضة المستقرة في آثار X-0 التي تم حلها دون ظهور وسيط يشير إلى أن حل كامل يحدث في غضون عمر مجمع GEN1 HJ. لاحظ أن الخلفية من سطح الزجاج الوظيفية يجب ألا تتجاوز بعض البقع وأن الجسيمات الموزعة بالتساوي ضرورية للحصول على نتائج جيدة.استخدم دائماً معدات الحماية الشخصية وغطاء أبخرة أثناء إعداد صورة التسلسل. تأكد من ارتداء نظارات واقية خاصة بأطوال الموجة عند العمل مع الليزر. أساليب أخرى مثل كريو أب، الرنين المغناطيسي النووي، يمكن أن توفر تفاصيل هيكلية المستوى الذري.هذه المعلومات هي جزء لا يتجزأ من تصميم وتفسير جزيء واحد تجارب فريت. جزيء واحد FRET فتح وجهات نظر جديدة في مجال النسخ المتماثل الحمض النووي مما أدى إلى فهم أعمق لآليات الإجراءات الهليفات والنيوكلاسيس.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

التحقيق في الدور النسخي لـ RUNX1 كاتم الصوت من قبل كريسبر/كاس9 ريبونوكليوبروتين في خلايا سرطان الدم النقوي الحاد

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...