该协议使我们能够监测在单分子水平和其他酶系统中通过活门内核糖酶1的相互作用动力学和霍利迪结的分辨率。那么，一些将平均在整个分子群体或确保潜在的个别机械步骤，有。单分子方法通过监测单个分子的实时行为来提供这些细节。
单分子方法可以有效地检测皮科和纳米摩尔范围内具有高特异性的生物分子相互作用。这对于诊断、基因组测序和传感方面的许多实用解决方案都很方便。光学和强制测量单分子方法在物理、化学和生物学中广泛应用，并被证明提供其他方法无法获取的高贵观测结果。
我给首次使用的用户的建议是，要密切遵循该协议中规定的详细步骤。本协议的动手程序的可视化说明将导致该技术的成功实现。要准备单通道流单元，请首先在 50 到 20 毫米石英滑梯的中间部分钻两个 1.22 毫米直径的孔，中间相距 37 毫米，距离滑道边缘 6.5 毫米。
使用电子切割机将 41 由 2.25 毫米的通道切割成 50 到 20 毫米的双粘合片，然后剥下保护盖的塑料面。将片的边缘与石英滑片的边缘对齐，并使用一对聚四氟乙烯钳子轻轻清除任何捕获的气泡。剥去粘合件的纸张侧，将该件安装到盖滑的实用表面上。
接下来，将一块内径为 1.22 毫米的聚乙烯管切成 11 厘米长的入口，将一根管材切割至 25 厘米的出水口。然后将管子插入先前钻孔，作为流动单元的入口和出口管。并使用五分钟环氧树脂密封进气管和出口管中石英盖滑接口的边缘。
当细胞干燥后，使用1毫米注射器冲洗0.2微米过滤0.03毫克每毫升浓度的阿维丁在PBS进入细胞使用第二个注射器，单独充满缓冲液，洗净任何多余的阿维丁在充血结束。要进行单色F FRET实验，首先将一滴浸入油涂抹在总内部反射荧光目标上，并设置光电子在芯片上乘法为合适的增益，以优化背景信号并防止饱和。小心地将流动单元放在样品架上，并使用过程调整逐渐提高目标，直到机油接触盖滑。
打开 532 纳米激光器并切换到目标的微调模式。将发射引导到摄像机端口以观察监视器上的图像并调整目标的高度，直到盖滑的实用表面聚焦，并在监视器上观察。在荧光标记 HJ 中流动之前，检查盖滑滑点功能化表面的背景是否不超过几个点。当系统在0.2至0.5微升的稀释基板准备时，将感兴趣的稀释基板放入120微升的成像缓冲液中，用氧气清除系统进入0.5毫升管中，将慢速电池的插座连接到注射器泵。
将进气管插入 1.5 毫升管中，以每分钟 30 至 50 微升的速度启动注射器泵，将溶液从管中抽出。经常用绿色激光对表面进行短暂成像，以确认具有 100 到 300 个均匀分布、空间良好的基材的粒子对细胞的覆盖良好。如果流细胞表面被充分覆盖，每分钟以30至50微升冲洗另外120微升成像缓冲液，以洗去任何未绑定的HJ，并允许流动细胞坐5分钟，使氧气擦伤系统消耗溶解氧。
将曝光时间设置为大约 60 毫秒。循环时间将由软件根据数据传输速度自动设置。指定所需的周期或帧数，以大约 400。
来自供体和接受器荧光的发射通过图像分路器装置分裂成颜色通道。在表面上选择一个合适的区域，调整目标的高度以聚焦图像和录制，然后以 16 位 tiff 格式保存影片。然后移动到一个新的区域。
用 120 微升成像缓冲液冲洗细胞，并以每分钟 30 微升的流量（一次一个浓度）以指示的 GEN1 浓度进行补充。在 HJ 裂解实验的分辨率中，将流速调整为每分钟 110 微升，并在酶进入流细胞前 5 到 10 秒开始记录。在酶进入流动细胞前5到10秒开始成像，将最大化事件的数量。
当所有浓度都经过测试后，使用固定的荧光珠幻灯片在图像分割装置中将供体和接受器粒子彼此映射。安装适当的软件包以生成转换矩阵后，打开录制的珠子幻灯片电影，并在供体和接受通道中选择单个珠子的位置。从固定珠子幻灯片生成矩阵时，单击"加载 TFORM"并选择转换矩阵文件。
在通道过滤器下拉菜单中，单击 D&A 选项以选择标有捐赠者和接受方的粒子。然后，按照手册中的指示输入绘图时间跟踪CW，为每个分子生成时间痕迹。要执行 ALEX FRET 实验，请用绿色和红色激光直接刺激，录制由连续帧的捐赠者和接受者排放的电影。
打开获得的ALEX电影，将由于捐赠者激发、供体激发的接受物发射和直接激励通道的接受器发射，将每个捐赠者排放的合适检测阈值设定在300个。应用适当的通道过滤器来选择同时是供体和接受方的粒子，并在三个通道中连接每个通道中的 200 到 300 个粒子。使用绘图HistALEX MATLAB代码生成在直方图函数中拟合不同峰值的 ALEX 直方图，并使用合适的图形和分析程序确定每个总体曲线下区域的百分比。
然后使用绘图TimetraceALEX MATLAB代码为每个分子生成时间跟踪，显示由于F FRET和直接激发而接受器发射中的直接激发的供体发射。此代表交替激发 FRET 直方图的相邻标签 X-0 显示两个峰，对应于更丰富和不太丰富的异构体的交换。从异构体的居住时间直方图中获得的异构率与先前报告的比率一致。
在ALEX获得的不同GEN1浓度下相邻标签X-0结的单分子FED直方图，在减去低F FRET峰值中不太丰富的异构体的贡献后，揭示了一个对应于自由高F FRET异构体的峰值和一个对应于绑定HJ总体的峰值。在饱和的 GEN1 浓度下，X-0 的 FRET 直方图只有一个与 GEN1 对应的低 FRET 峰值，并绑定到模型预测的 HJ 的任一异构体。GEN1单体与HJ的结合，然后是二丁体形成，是真核HJ溶解酶GEN1的一个独特特征，与在溶液中以二毛形式存在的原核溶解酶相比。
GEN1 单体结合和扭曲的 HJ 的进一步证据是观察大量未清除颗粒的痕迹，这些颗粒在低 GEN1 浓度下存在镁时具有稳定的低 FRET 状态。捐赠者和接受方在稳定低 FRET 状态后同时离开，在已解析 X-0 的痕迹中发生，而不出现中间体，表明在 GEN1 HJ 复合体的生命周期内发生完全分辨率。请注意，功能化玻璃表面的背景不应超过几个点，均匀分布的颗粒对于获得良好结果至关重要。
在准备序列化图片时，始终使用个人防护设备和防烟罩。使用激光时，请务必佩戴特定于波长的保护眼镜。其他方法，如低温ap，核磁共振，可以提供原子级结构细节。
此信息对于单分子 FRET 实验的设计和解释是不可或缺的。单分子F FRET在DNA复制领域打开新的观点，从而更深入地理解了反应和核酸酶的活性机制。
