Name: single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Kong Abdullah University of Science and Technology gennem Core Funding og konkurrencedygtig Research Award (CRG3) til S. M. H.

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

I denne undersøgelse, forskellige smFRET teknikker blev implementeret for at bestemme kinetikken af HJ resolution af GEN130. Lignende smfret tilgange blev brugt til at følge dobbelt-flap DNA konformationsmæssige krav og spaltning af DNA replikation og reparation flap endonuklease 142,43,44. Her diskuteres kritiske trin i denne protokol. Den silanisering reaktion bør være fri for ethvert spor af fugt. Pegylations opløsningen skal anvendes hurtigt på det silaniserede glas, når PIND er opløst for at undgå hydrolyse. I multikanal flowcellen skal enhver fanget luft i klæbe arket fjernes for at undgå lækage mellem tilstødende kanaler. PCA-løsningen skal være frisk tilberedt, da den oxiderer over tid. Tilføjelsen af 10 N NaOH bør være dropwise, med vortexning i mellem. Fluorescens baggrund i dæksedlen skal være minimal, før den flyder fluorescently mærket HJ. Billedbehandlings forløbet i flowcellen skal udføres i én retning for at undgå, at der opstår blegede områder. I ALEX eksperimenter, kraften i den røde laser bør reduceres for at undgå hurtig blegning af acceptoren. I tidsforskudt eksperimenter skal cyklustid være kortere end den hurtigste hændelse.
smFRET er en følsom teknik, der kan give værdifuld real-time indsigt i biomolekulære reaktioner. Men denne metode har flere tekniske udfordringer, blandt hvilke er at opnå målbare ændringer i FRET under den biokemiske reaktion. Dette er nødvendigt for at opnå veladskilte funktioner i histogrammer og skelne stater i tids-spor. I mange tilfælde kræver smfret omhyggelig design af substrater, udvælgelse af fluoroforet par og deres positioner, og forstærkning af Fret ændringer i DNA-substrat på grund af de små strukturelle ændringer i substrat45. En anden metode til at udføre FRET er at bruge mærkede proteiner46. Observationsvinduet i FRET er begrænset af acceptorens stabilitet såsom Cy5 eller Alexa fluor 647, som har tendens til at blege hurtigere end donor (Cy3 i dette tilfælde). Derfor kræver fret en kontinuerlig søgning efter stabile fluorophorer for at forlænge eksperimentets varighed og bestræbelserne på at udvikle iltskylle systemer for at forlænge fluorescens signalet og maksimere signal-støj-forholdet47,48 .
Blandt de tips til fejlfinding i smFRET balancerer de mange parametre, der er involveret i Imaging såsom laser effekt, eksponeringstid, cyklustid, og antallet af cyklusser for at maksimere fluorescens emission, forlænge eksperimentet varighed, og opnå passende prøvetagnings intervaller for enzym dynamikken. Længere observations tider og minimale effekter fra foto blegning er afgørende for at opnå high fidelity dtids fordelinger, der repræsenterer enzym dynamikken. ALEX genererer bedre histogrammer, da denne metode er udsat for lavere bidrag fra foto blegede partikler sammenlignet med enkelt farve-FRET. Men den tidsmæssige opløsning i ALEX er lavere end i enkelt farve-FRET.
Endelig lægger smFRET vægt på at påvise konformationelle/strukturelle ændringer i individuelle molekyler i realtid broer kløften mellem høj opløsning strukturelle teknikker (dvs., røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans, elektronmikroskopi), som giver atomare opløsning strukturelle detaljer under statiske forhold og bulk metoder, der leverer ensemble gennemsnit af en målbar egenskab. I mange henseender har smFRET vist sig at være en kraftfuld teknik til at studere biologiske systemer i realtid.

Enkelt molekyle metoder baseret på fluorescens detektering giver høje signal-støj-nøgletal1. FRET er en spektroskopisk teknik, der kan måle afstande i intervallet 1 – 10 nm, hvilket gør denne teknik som en molekylær lineal til måling af afstande i nanometer området2,3. Acceptors absorptionsspektrum har en delvis spektral overlapning med donorens emissions spektrum ved den kortere bølgelængde. FRET er medieret af stråling-mindre energioverførsel mellem en donor og acceptor par, mens effektiviteten af energioverførsel er afhængig af afstanden og retningen af acceptoren4.
Flere tilgange er blevet implementeret for at minimere baggrunden og forbedre detekterings effektiviteten af fluorescens signalet5,6. En fremgangsmåde er Konfokal mikroskopi, hvor et hul begrænser excitation stedet til en størrelse under diffraktionen grænse7. En anden fremgangsmåde er total intern refleksion fluorescens (TIRF), som er en bred-felt belysning teknik, hvor lyset er rettet off-akse over en kritisk vinkel8. Lyset er derefter helt internt afspejlet i grænsefladen mellem glas og vandig opløsning, genererer en passive bølge, der kun oplyser de fluorophorer fastgjort til glasoverfladen og forhindrer baggrunden fra fluorophorerne i resten af løsningen.
I Konfokal mikroskopi kan molekylerne enten være frit sprede eller overflade immobiliseret. Den opnåede tidsmæssige opløsning kan være inden for mikrosekunder til flere millisekunder9. Konfokal detektering for et enkelt molekyle udføres af Single-photon Avalanche Diode (SPAD) og punkt-for-punktscanning af regionen af interesse10. I TIRF, en tidsserie af et par hundredvis af molekyler immobiliseret på overfladen er registreret af en positions-følsom to-dimensionel ladning koblet detektor (CCD). CCD forstærker fluorescens signalet enten ved intensiveret fosfor-skærm og mikrokanal plade eller på-chip-multiplikation af fotoelektroner (emccd). Den tidsmæssige opløsning er afhængig af udlæsningshastigheden og kvante effektiviteten af CCD og normalt på rækkefølgen af få snesevis af millisekunder6.
HJ er et centralt mellemprodukt i DNA-reparation og rekombination11,12,13,14. HJ har to kontinuerlige og to krydsning tråde, der forbinder mellem de kontinuerlige tråde uden at krydse hinanden. HJ findes i opløsning som X-stacked konformatorer, som undergår kontinuerlig isomerisering af de kontinuerlige tråde bliver krydser og passage tråde bliver kontinuerlig i den anden konformer15. Isomer præference af HJ er afhængig af kernen sekvens og ionisk miljø og er blevet grundigt undersøgt af Fret16,17,18,19.
GEN120 er et monomerisk protein i løsning21 og kræver denne for at kløve HJ, hvilket giver mulighed for korrekt adskillelse af de rekombinerede tråde22,23. Den stabling konformer præference af HJ påvirker resultatet af genetisk rekombination ved at indstille retningen af opløsningen af HJ resolvases24. Forstå hvordan GEN1 binder HJ, koordinerer de to snit, og sikrer sin fulde opløsning har alle været under intensiv undersøgelse21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denne undersøgelse anvendes en objektiv baseret TIRF-opsætning som beskrevet tidligere31. To-farve alternerende excitation (Alex) anvendes til at bestemme de konformationsmæssige ændringer på interaktionen af GEN1 med fluoroforet mærket HJ. Alex producerer 2D histogrammer baseret på to ratiometriske parametre fret effektivitet E, som er donor-acceptor distance-afhængige, og støkiometri parameter S, som måler donor-acceptor støkiometri32. ALEX tillader sortering af fluorescerende arter baseret på de støkiometries af fluorophorerne, herunder donor-only, acceptor-only, og blandede delpopulationer. Alex kan udvide brugen af Fret til hele spektret og kan detektere forskelle i fluoroforet lysstyrke og oligomerisering samt overvåge makromolekyle-ligand interaktioner33.
Det er konstateret, at GEN1 konsekvent lykkes at løse HJ inden for levetiden af GEN1-HJ-komplekset. De tidsafhængige konformationsmæssige ændringer er afledt af tids-spor af individuelle molekyler, mens histogrammer repræsenterer fordelingen af de underliggende populationer. Ved hjælp af time-lapse enkelt-farve fret, hurtig on-rate og langsom off-satser for GEN1 dimer er demonstreret, som øger affiniteten af den samlede GEN1 dimer på det første indsnit produkt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NAPO 1.49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>741442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% Novex Tris-Borate-EDTA gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive sheet</td>
			<td>Grace bio-labs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cation exchange column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>MonoS (4.6/100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell distruptor</td>
			<td>Constant Cell Disruption System</td>
			<td>TS5/40/CE/GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>808274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ600/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ700/40M-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic for DV2 filter cube</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>630dcxr-18x26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>200-1/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic cutter</td>
			<td>Copam</td>
			<td>CP-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelQuant.NET software</td>
			<td>biochemlabsolutions.com</td>
			<td>Version 1.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEN1 entry vector</td>
			<td>Harvard plasmid repository</td>
			<td>HSCD00399935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green laser (emission 532 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Compass 315M-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HiTrap Heparin column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Dualview (DV2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Goldbio.</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass 532nm filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LPD02-532RU-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-SVA 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>HisTrap FF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris gels</td>
			<td>Novex Life technologies</td>
			<td>NP0301BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0302PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Version 8.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-184-G025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm)</td>
			<td>Fisher (Becton Dickinson)</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band dichroic</td>
			<td>Chroma Inc</td>
			<td>Z405/488/532/640rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red laser (emission 640 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Cube 640 100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tweezers</td>
			<td>Rubis</td>
			<td>K35A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC90300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule f&ouml;rster resonance energy transfer methods for real-time investigation of the holliday junction resolution by gen1

Bulk metoder måle ensemblet opførsel af molekyler, hvor individuelle reaktions rater af de underliggende trin er gennemsnit i hele befolkningen. Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel (smFRET) giver en registrering af de konformationsmæssige ændringer, der finder sted af individuelle molekyler i realtid. Derfor er smFRET stærk til at måle strukturelle ændringer i enzymet eller substratet under binding og katalyse. Dette arbejde præsenterer en protokol for single-molekyle billeddannelse af samspillet mellem en fire-vejs Holliday Junction (HJ) og Gap endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homologe rekombination enzym. Også præsenteret er enkelt-farve og to-farve alternerende excitation (ALEX) smFRET eksperimentelle protokoller til at følge opløsningen af HJ af GEN1 i realtid. Kinetikken af GEN1-denne bestemmes på HJ, som er blevet foreslået at spille en central rolle i opløsningen af HJ og er forblevet undvigende indtil nu. De teknikker, der beskrives her, kan anvendes bredt for at opnå værdifuld mekanistisk indsigt i mange enzym-DNA-systemer.

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1 at JoVE.com

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Præsenteret her er en protokol til udførelse af Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel til at studere HJ opløsning. To-farve alternerende excitation bruges til bestemmelse af dissociations konstanter. Enfarvet tidsforskydning smFRET påføres derefter i realtid spaltning assays for at opnå den pause tidsfordeling før HJ opløsning.

Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel metoder til real-time undersøgelse af Holliday Junction resolution af GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Denne protokol gør det muligt for os at overvåge interaktionsdynamikken og opløsningen af Holliday-krydset ved flap endonuclease 1 på enkeltmolekyleniveau og andre enzymatiske systemer. Nå, vil nogle gennemsnit i hele den molekylære befolkning eller sikrer de underliggende individuelle mekanistiske skridt, og der er. Enkelt molekyle metoder giver disse oplysninger ved at overvåge real-time adfærd af de enkelte molekyler.Enkeltmolekyle metoder kan effektivt detektere biomolekylære interaktioner i pico og nanomolar område med høj specificitet. Hvilket er praktisk til mange praktiske løsninger inden for diagnostik, genomsekvensering og sensing. Optiske og tvungne måling enkelt-molekyle metoder er almindeligt anvendt i fysik, kemi og biologi og har vist sig at give ædle observationer, der er utilgængelige ved andre metoder.Mit råd til første gangs brugere er nøje at følge de detaljerede trin, der er fastsat i denne protokol. Visuelle illustrationer af hands-on procedure af denne protokol vil føre til en vellykket gennemførelse af teknikken. For at forberede den enkelte kanal flow celle, begynde med at bore to 1,22 millimeter-diameter huller i den midterste del af en 50 af 20 millimeter kvarts dias med centrene 37 millimeter fra hinanden og 6,5 millimeter fra kanten af diaset.Brug en elektronisk fræser til at skære en 41 af 2,25 millimeter kanal i en 50 af 20 millimeter stykke af en dobbelt selvklæbende plade og skræl plastsiden af beskyttelsesdækslet. Juster kanterne af stykket med kanterne af kvarts dias og bruge et par polytetrafluorethylen pincet til forsigtigt at fjerne eventuelle fanget luftbobler. Skræl papirsiden af det klæbende stykke og monter stykket på den funktionaliserede overflade af en dækselseddel.Dernæst skæres et stykke polyethylenrør med en indvendig diameter på 1,22 millimeter til en 11 centimeter lang længde for indløbet og et stykke slange til 25 centimeter for udløbet. Sæt derefter rørene i de tidligere borede huller, da indløbs- og udløbsrørene til flowcellen. Og brug fem minutters epoxylim til at forsegle kanterne af kvartsdækslet slip interface i indløb og udløbsrør.Når cellen er tørret, skal du bruge en 1 millimeter sprøjte til at skylle 0,2 mikrometer filtreret 0,03 mg pr. milliliter koncentration avidin i cellen ved hjælp af en anden sprøjte fyldt med buffer alene for at vaske overskydende avidin i slutningen af overflod. For at udføre en enkelt-farve FRET eksperiment, først anvende en dråbe nedsænkning olie på en 100 gange total intern refleksion fluorescens mål og indstille på chip multiplikation af fotoelektroner til en passende gevinst for at optimere signalet til baggrunden og for at forhindre mætning. Placer forsigtigt flowcellen på prøveholderen, og brug kursjusteringen til gradvist at hæve målet, indtil olien rører dækslet.Tænd for 532 nanometer laser og skifte til finjustering tilstand af målet. Direkte emissionen til kameraporten for at observere billedet på skærmen og justere højden af målet, indtil dækslets funktionaliserede overflade bringes i fokus og kan observeres på skærmen. Kontroller, at baggrunden fra dækslets funktionaliserede overflade ikke overstiger nogle pletter, før den flyder i den fluorescerende mærkede HJ. Når systemet er klar ved 0,2 til 0,5 mikroliter af det fortyndede substrat af interesse i 120 mikroliter af billedbuffer med iltspisningssystem i et 0,5 milliliterrør, og udløbet af den langsomme celle forbindes til en sprøjtepumpe.Sæt indløbsrøret i 1,5 milliliterrøret, og start sprøjtepumpen ved en 30 til 50 mikroliter i minuttet for at trække opløsningen ud af røret. Billede ofte overfladen kort med den grønne laser for at bekræfte en god dækning af cellen med 100 til 300 partikler af homogent fordelt, godt fordelt substrat. Hvis flowcelleoverfladen er tilstrækkeligt dækket, skal du skylle yderligere 120 mikroliter billedbuffer ved 30 til 50 mikroliter i minuttet for at vaske enhver ubundet HJ væk og lade flowcellen sidde i 5 minutter, så iltskulptursystemet kan nedbryde den opløste ilt.Indstil eksponeringstiden til ca. 60 millisekunder. Cyklustiden vil automatisk blive indstillet af softwaren baseret på hastigheden af dataoverførsel. Angiv det ønskede antal cyklusser eller rammer til ca. 400.Emissionen fra donor og acceptor fluorophores er opdelt i farvekanaler af et billede splitter enhed. Vælg et passende område på overfladen, juster højden på målsætningen for at fokusere billedet og optage og gemme filmen i 16 bit tiff-format. Derefter flytte til et nyt område.Skyl cellen med 120 mikroliter billedbuffer suppleret med de angivne koncentrationer af GEN1 ved en strømningshastighed på 30 mikroliter pr. minut, én koncentration ad gangen. I opløsningen af HJ spaltning eksperiment, justere strømningshastigheden til 110 mikroliter i minuttet og starte optagelsen 5 til 10 sekunder før indgangen til enzymet i flowcellen. billeddannelsen til at starte 5 til 10 sekunder før indgangen til enzymet ind i flowcellen vil maksimere antallet af hændelser.Når alle koncentrationer er blevet testet, skal du bruge en fast fluorescerende perle slide til at kortlægge donor og acceptor partikler til hinanden i billedet opdeling enhed. Efter installation af den relevante softwarepakke til at generere en transformation matrix, åbne den optagede perle slide film og vælge placeringen af de enkelte perler i donor og acceptor kanaler. Når matrixen er genereret fra det faste perledias, skal du klikke på Indlæs TFORM og vælge transformationsmatrixfilen.Klik på d&A-indstillingen i rullemenuen kanalfilter for at vælge for partikler, der er mærket med både donoren og acceptoren. Indtast derefter plotTimetraceCW som anvist i manualen for at generere tidssporene for hvert molekyle. For at udføre et ALEX FRET eksperiment, optage en film bestående af på hinanden følgende billeder af donor og acceptor emissioner ved direkte excitations med de grønne og røde lasere.Åbn de erhvervede ALEX-film, og angiv den passende detektionstærskel på ca. 300 for hver donoremission på grund af donorexcitation, acceptoremission på grund af donorexcitation og acceptoremission på grund af de direkte excitationskanaler. Anvend de relevante kanalfiltre for at vælge for de partikler, der har været både donor og acceptor, og sammenkæd 200 til 300 partikler i hver af de tre kanaler. Brug plotHistALEX MATLAB-koden til at generere ALEX-histogrammer, der passer til forskellige toppe i histogrammets funktioner, og brug et passende graf- og analyseprogram til at bestemme procentdelen af området under kurven for hver population.Brug derefter plottetTimetraceALEX MATLAB-kode til at generere et tidsspor for hvert molekyle, der viser donoremissionen ved direkte excitation i acceptoremissionerne på grund af FRET og den direkte excitation. Denne repræsentative vekslende ophidselse FRET histogram af tilstødende etiket X-0 viser to toppe, der svarer til udveksling af de mere rigelige og mindre rigelige isomerer. Den isomerization satser opnået fra Dwell tid histogrammer af isomerer er i overensstemmelse med dem, der er rapporteret tidligere.Enkelt molekyle FRET histogrammer af den tilstødende etiket X-0 krydset ved forskellige GEN1 koncentrationer erhvervet af ALEX, afslører en top svarende til den frie høje FRET isomer og en top svarende til den bundne HJ befolkning efter at trække bidraget fra de mindre rigelige isomer fra den lave FRET peak. Ved en mættende GEN1-koncentration har FRET-histogrammet X-0 kun en enkelt lav FRET-top svarende til GEN1, der er bundet til enten Isomer af HJ som forudsagt af modellen. Bindingen af GEN1 monomer til HJ efterfulgt af dimer formation er et unikt træk ved den eukaryote HJ resolvase GEN1 sammenlignet med prokaryote resolvases, der findes i dimeric form i opløsning.Yderligere beviser for, at GEN1 monomer binder og fordrejer HJ er observation af et betydeligt antal spor af uncleaved partikler med en stabil lav FRET tilstand i nærvær af magnesium ved lave GEN1 koncentrationer. Donorens og acceptorens samtidige afgang efter en stabil lav FRET-tilstand i spor af løst X-0, der opstår uden fremkomsten af et mellemprodukt, indikerer, at der sker en fuldstændig opløsning inden for GEN1 HJ-kompleksets levetid. Bemærk, at baggrunden fra den funktionaliserede glasoverflade ikke må overstige nogle få pletter, og at jævnt fordelte partikler er afgørende for at opnå gode resultater.Brug altid personlige værnemidler og en røghætte, mens du forbereder serialiseringsbilledet. Sørg for at bære beskyttelsesbriller, der er specifikke for bølgelængderne, når du arbejder med lasere. Andre metoder såsom cryo ap, nuklear magnetisk resonans, kan give atomare niveau strukturelle detaljer.Disse oplysninger er en integreret del af designet og fortolkningen af fret-eksperimenterne med et enkelt molekyle. Enkelt molekyle FRET åbne nye synspunkter inden for DNA replikation resulterer i dybere forståelse af mekanismerne i handlinger helicases og nukleaser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Påvisning af mikroRNA ekspression i peritoneal membran af rotter ved hjælp af kvantitativ real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Omdanne, genomredigering og Phenotyping kvælstofbindende tropisk Cannabaceae træ Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transskriptionelt plasmidekspressionssystem til undersøgelse af stabiliteten af mRNA-udskrifter i primære alveolære epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...